墊狀卷柏SpLEA1基因克隆及干旱脅迫下的表達分析

周璇 高鵬華 鄢波

摘 要：? 晚期胚胎發(fā)育豐富蛋白（late embryogenesis abundant，LEA），廣泛存在于生物體內，與植物抗逆性密切相關，可在干旱脅迫下保護植物細胞，減少植物損傷。墊狀卷柏（Selaginella pulvinata）是一種在干旱脅迫下生存能力極強的蕨類植物，具有很強的恢復能力。為探究墊狀卷柏SpLEA1基因在耐旱植物中的分子機制與表達特征，該研究以高耐旱性植物墊狀卷柏為實驗材料，基于轉錄組測序結果，采用RT-PCR技術獲得SpLEA1基因cDNA序列，采用HiTail-PCR技術獲得啟動子序列，利用生物信息學對序列進行了分析，并采用qRT-PCR技術分析了SpLEA1基因在干旱脅迫下的表達模式。結果表明：（1）墊狀卷柏SpLEA1全長為476 bp，開放閱讀框（ORF）為279 bp，共編碼92個氨基酸，通過在線工具預測到蛋白分子量為9 491.46 Da， 等電點為5.45，蛋白結構預測分析表明該蛋白為親水性蛋白，含有10個磷酸化位點，二級結構以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。（2）預測到SpLEA1蛋白的保守結構域為Lea-5，來源于LEA1家族。基于系統(tǒng)發(fā)生樹和遺傳距離矩陣，發(fā)現墊狀卷柏SpLEA1與來自鷹嘴豆（Cicer arietinum ）和紅車軸草（Trifolium pratense）的Lea-5蛋白同源性較高。（3）對啟動子序列進行順式作用元件的預測分析發(fā)現SpLEA1基因啟動子含有5類激素響應元件和與干旱脅迫響應有關的功能元件。（4）在自然干旱處理下SpLEA1基因表達上調，并在12 h時達到峰值，在24 h干旱后進行復水處理，表達量顯著下調。綜上所述，SpLEA1基因在墊狀卷柏中很可能參與了干旱脅迫響應機制的相關調控。該結果為進一步研究墊狀卷柏SpLEA1基因在干旱脅迫下的功能及其表達調控機制提供了參考。

關鍵詞： 墊狀卷柏， SpLEA1， 基因克隆， 啟動子克隆， 表達分析

中圖分類號：? Q943

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2023）02-0347-10

Cloning and expression analysis of the SpLEA1 gene

of Selaginella pulvinata under drought stress

ZHOU Xuan， GAO Penghua， YAN Bo*

（ College of Landscape Architecture and Horticulture Sciences， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China ）

Abstract：? Late embryogenesis abundant （LEA） is widely present in organisms and closely related to plant resistence， it can protect plant cells and? reduce plant damage under drought stress. Selaginella pulvinata is a fern with the ability to survive drought stress， with a strong recovery ability under drought stress. To investigate the molecular mechanisms and expression characteristics of the SpLEA1 gene in drought-tolerant plants， we used the highly drought-tolerant plant S. pulvinata as experimental material and obtained the cDNA sequence of the SpLEA1 gene by RT-PCR based on the transcriptome sequencing results. The promoter sequence was obtained by the HiTail-PCR technique， and the sequence was analyzed by bioinformatics. qRT-PCR was used to analyze the expression pattern of the SpLEA1 gene under drought stress. The results were as follows： （1） The length of SpLEA1 was 476 bp， the open reading frame （ORF） was 279 bp， and it encoded 92 amino acids. The predicted molecular weight of the protein was 9 491.46 Da， and the isoelectric point was 5.45. The predicted protein structure analysis showed that the protein was hydrophilic. The protein contained ten phosphorylation sites， of which six serines， three tyrosines， and one threonine， respectively， and the predicted secondary structures showed that the protein was mainly composed of α-helix and random coil. （2） The conserved structural domain of the SpLEA1 protein was predicted to be Lea-5， derived from the LEA1 family. Based on the phylogenetic tree and genetic distanced matrix， the SpLEA1 was found to have high homology with Lea-5 protein from Cicer arietinum and Trifolium pratense. （3） Predictive analysis of cis-acting elements in promoter sequenced revealed that the SpLEA1 gene promoter contained five classes of hormone response elements and functional elements related to the drought stress response. The SpLEA1 gene was hypothesized to have multiple functions in the plant body and was closely related to drought stress response mechanisms. （4） SpLEA1 gene expression was up-regulated under natural dehydration treatment and peaked in 12 h. After rehydration treatment for 24 h， expression was significantly down-regulated. In summary， the SpLEA1 gene is likely to be involved in the regulation of drought stress response mechanisms in matted curly cypress. This results provide the reference for further studies on the function of the matted cypress SpLEA1 gene under drought stress and its expression regulation mechanism.

Key words： Selaginella pulvinata， SpLEA1， genetic cloning， promoter cloning， expression analysis

植物在長期進化過程中，對外界的生物脅迫與非生物脅迫有系統(tǒng)的生理及分子響應機理。研究報道指出，胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白 （late embryogenesis abundant，LEA）與植物抗逆性相關，廣泛參與植物對非生物脅迫的響應過程（李翔，2016）。LEA蛋白最初是在棉花種子中分離克隆得到的（Dure et al.， 1981），之后研究發(fā)現LEA蛋白廣泛存在于植物、無脊椎動物及原核生物中。LEA基因在植物的整個發(fā)育階段均有表達，特別是在植物遭受如干旱，高溫等環(huán)境脅迫時，LEA基因在植物組織細胞中大量表達，積累豐富的LEA蛋白以應對外界環(huán)境（Wise， 2003；Silveira et al.， 2008）。Hunault和Jaspard（2010）建立了LEA蛋白數據庫（Late Embryogenesis Abundant Proteins database，LEAPdb），根據LEA蛋白氨基酸序列的8個保守的PFAM結構域對LEA蛋白成員進行生物信息學分析。通過LEA蛋白數據庫確認研究中所提取的LEA蛋白的PFAM號，可以確定其所屬的LEA蛋白家族，為后續(xù)實驗提供理論依據。 LEA1（group 1 late-embryogenesis-abundant proteins）是以無規(guī)則結構形式存在的親水性蛋白，在植物中廣泛分布，典型代表為棉花D-19、小麥EM蛋白、大麥B19蛋白等。LEA1家族成員均具親水性，各成員之間具有親水性極高的20個氨基酸保守基序（GGETRKEQLGEEGYREMGRK），其數量多變（Stacy et al.， 1995）。

在植物中克隆目的基因的啟動子能進一步系統(tǒng)分析基因的功能。植物啟動子是一段含有轉錄起始位點，調控基因表達的DNA序列，啟動子的轉錄頻率、起始方向和位點均是基因轉錄調控表達的關鍵（Liu et al.， 1997；王志新等，2011；張曦予等，2019）。啟動子主要包含一些特異性的調控基序（梅玉芹，2018），在結構和功能上可以分為組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異型啟動子（楊瑞娟等，2018）。研究表明，誘導型啟動子在外界環(huán)境因素發(fā)生改變時，會使基因瞬時或持續(xù)性上調表達（Durzo et al.， 2013）。Zheng等（2019）從卷心菜中分離得到了一個非典型LEA基因LpLEA基因及其啟動子序列，分析表明中LpLEA基因的啟動子中存在與非生物脅迫有關的獨特順式作用調控元件，LpLEA基因在不同非生物脅迫及脫落酸誘導下在不同部位表達量均提高。

墊狀卷柏（Selaginella pulvinata）又名九死還魂草，主要分布于我國的干旱地區(qū)，常生長于裸露的石灰?guī)r表面或者石縫中，具有很強的耐旱性，屬于蕨類植物門墊狀卷柏科墊狀卷柏屬土生或石生的復蘇植物（吳征鎰，2004）。研究表明，墊狀卷柏具有獨特的活性氧生成和清除調節(jié)途徑，增強脫落酸生物合成和潛在的調節(jié)脫落酸信號及對脫落酸響應的機制，且經過葉綠體基因組分析發(fā)現其葉綠體結構具有獨特的重排且葉綠體NAD（P）H脫氫酶（NDH）基因完全缺失（Saucedo et al.， 2017）。因為LEA1蛋白可在植物幼苗時期受干旱、鹽脅迫、ABA以及低溫脅迫誘導表達，并且對植物體內乳酸脫氫酶的活性有保護作用，同時可正向調控部分鈣依賴性蛋白激酶的表達（鄒永東，2011；Xiang et al.， 2018），所以LEA1蛋白作為參與植物耐受性調控的重要蛋白在高耐旱植物墊狀卷柏中發(fā)揮的作用值得探究。但是目前，有關蕨類植物LEA蛋白的研究較少，而在蕨類植物墊狀卷柏中LEA1基因的研究幾乎為空白。因此，在墊狀卷柏中克隆LEA1基因并分析其分子機制及表達特征，對其在墊狀卷柏抗旱過程中的調控機制進行深入研究具有重要意義。本研究分離克隆了墊狀卷柏SpLEA1基因，對SpLEA1基因序列及啟動子順式作用元件進行了生物信息學分析，構建了系統(tǒng)發(fā)生樹和遺傳距離矩陣，對同源蛋白序列進行了比對，并利用實時熒光定量技術檢測了墊狀卷柏幼嫩葉片不同干旱狀態(tài)下的表達情況，可為進一步探索SpLEA1基因在干旱脅迫下的功能及分子作用機制奠定基礎，同時，也可為園林園藝觀賞植物的抗旱性改良提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

墊狀卷柏采于云南省昆明市郊區(qū)，采集后進行培養(yǎng)箱培養(yǎng)（16 h日照；25 ℃；相對濕度20%）。采用墊狀卷柏新鮮枝葉提取DNA和cDNA；基因表達分析采用從巖石表層采集植株根部土壤含量較低的墊狀卷柏植株，對實驗材料根部充分澆水后，進行自然干旱處理，在處理時間點進行新鮮幼嫩枝葉采集，分為6個處理組，分別為0 h（根部充分著水，對照組）、自然干旱2、4、12、24 h和24 h后復水2 h組（復水組在干旱24 h后立即給予充足水分）。各處理組選取6個長勢一致的植株，3個生物學重復，每個處理后的樣本液氮速凍于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 SpLEA1基因DNA 的克隆 墊狀卷柏總DNA的提取按照小量植物（葉）總DNA抽提試劑盒（北京天根生化公司）的說明書提取。根據本實驗室轉錄組測序結果，設計SpLEA1基因全長引物（表1），以墊狀卷柏DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系：DNA 模板 2.0 μL、2×Taq PCR MasterMix 16 μL、上下游引物各1.0 μL、ddH2O 20 μL，終體積40 μL。PCR擴增程序：94 ℃，預變性，2 min；94 ℃，變性，30 s，57 ℃，退火，30 s，72 ℃，延伸，90 s，38個循環(huán)；72 ℃，延伸，10 min；4 ℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并使用凝膠回收試劑盒（OMEGA公司）純化PCR產物，連接到克隆載體PMD18-T（寶日醫(yī)生物技術）中，轉化大腸桿菌（E. coli） DH5α（天根生化生物公司），經菌液PCR鑒定后送生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.2 SpLEA1基因cDNA 的克隆

墊狀卷柏的總RNA按照總RNA提取試劑盒（OMEGA公司）的說明書提取。參照逆轉錄試劑盒（全式金生物技術有限公司）的使用說明書方法，使用提取的RNA作為模板進行逆轉錄反應。以墊狀卷柏cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增（引物、PCR反應體系和程序同1.2.1相同），轉化克隆、測序，獲得cDNA全長。

1.2.3 SpLEA1基因啟動子的克隆

以墊狀卷柏DNA為模板，結合LEA1基因序列設計啟動子特異引物SpLEA1Q1/2/3，分別作為第一、第二、第三輪特異引物，依次與隨機引物組合，進行HiTail-PCR擴增，隨機引物采用Liu和Chen（2007）設計的LAD1-1/2/3/4（表1）。選擇第三輪產物進行電泳檢測，將切取目的條帶進行連接、轉化、克隆后送去測序。

1.2.4 生物信息學分析 利用ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸的理化性質；利用Softberry（http：//linux1.softberry.com/berry.）分析基因的結構信息；利用NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測磷酸化位點；利用Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白親/疏水性；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進行二級結構預測及分析；利用Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）通過同源建模建立三級模型；利用DNAMAN9 軟件獲得多序列結構域比對圖并分析遺傳距離矩陣；利用MEGA X軟件構建系統(tǒng)進化樹；利用在線軟件PlantCARE（https：//bioinformat-ics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/heml/）對啟動子順式作用元件進行分析。

1.2.5 SpLEA1的qRT-PCR表達 利用qRT-PCR技術分析墊狀卷柏SpLEA1基因在干旱脅迫處理下的表達，根據獲得的墊狀卷柏SpLEA1基因序列設計一對SpLEA1定量PCR引物，以卷柏Actin為內參基因（表1），以cDNA為模板，利用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ說明書（Takara，RR820A）進行qRT-PCR分析，每個樣品3次重復以減小誤差，反應程序：95 ℃，預變性，30 s；95 ℃，變性，5 s，60 ℃，退火，30 s，40個循環(huán)。每個樣品設有3次重復，采用2-△△Ct法。

2 結果與分析

2.1 SpLEA1基因的克隆

以墊狀卷柏總DNA為模板，結合引物SpLEA1-F/R進行PCR擴增，經測序鑒定獲得全長475 bp的SpLEA1基因。以cDNA為模板，采用SpLEA1-F/R為引物，克隆獲得279 bp的SpLEA1基因cDNA序列（圖1：A）。測序結果表明，SpLEA1基因含有1個內含子（196 bp）和2個外顯子（115 bp和164 bp），cDNA長度為279 bp，編碼92個氨基酸（圖1：B）。根據NCBI的PFAM數據庫查詢，得到SpLEA1蛋白在2～88氨基酸位點含有保守結構域LEA-5，PFAM號是PF00477，表明墊狀卷柏SpLEA1基因屬于LEA1家族。

通過SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線預測墊狀卷柏SpLEA1蛋白質二級結構，由圖1：C可知，α-螺旋占40.22%，β-轉角占18.48%，無規(guī)則卷曲占36.96%，延伸鏈占4.35%，采用Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線工具進行同源建模，預測其三級結構。墊狀卷柏SpLEA1蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成，β-轉角和延伸鏈占比較小。

2.2 SpLEA1的生物信息學分析

通過ExPASy-ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）預測分析， SpLEA1基因編碼蛋白質相對分子量為9 491.46 Da，理論等電點5.45，分子式為C397H659N123O142S2，帶負電荷（Asp + Glu）的殘基總數為16，帶正電荷（Arg + Lys）的殘基總數為14。不穩(wěn)定指數為28.72，該蛋白為穩(wěn)定蛋白。SpLEA1蛋白含有Thr（4.3%）、Lys（9.8%）、Gln（5.4%）、Gly（18.5%）、Glu（13.0%）親水性氨基酸，還含有Ala（12.0%）、Met（2.2%），Val（3.3%）、Ile（3.3%）、Leu（6.5%）疏水性氨基酸。經計算，親水性氨基酸占51%，疏水性氨基酸占27.4%，平均親水指數為-0.838。

通過Protscale（http：//www.expasy.ch/tools/protscale.html）在線預測分析墊狀卷柏SpLEA1蛋白的親/疏水性。結果表明，小于0的親水性氨基酸占多數，大于0的疏水性氨基酸只占少數，在第68位氨基酸有最大值為0.892，該處疏水性最強，在第43位氨基酸有最小值為-2.433，該處親水性最強（圖2），說明SpLEA1蛋白屬于親水性蛋白。

利用NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線預測發(fā)現SpLEA1蛋白發(fā)生磷酸化修飾的位點共有10個。其中，絲氨酸有6個 （Serine位點為3、29、57、66、67、86），而酪氨酸有3個（Tyrosine位點為19和25），蘇氨酸僅有1個（Threonine位點56）。

用BLAST進行序列相似度分析，將墊狀卷柏SpLEA1蛋白與鷹嘴豆、芝麻、黑麥等15種親緣關系較近但物種不同的蛋白序列進行比對（圖3）。多重序列比對（圖3）結果顯示，SpLEA1蛋白含有LEA-5保守結構域，并在遺傳距離矩陣中發(fā)現，紅車軸草和鷹嘴豆與墊狀卷柏SpLEA1的遺傳距離最近（為0.272），薺菜與墊狀卷柏SpLEA1的遺傳距離最遠（為0.348）。利用MEGAX構建系統(tǒng)進化樹，并使用DNAMAN進行遺傳距離矩陣分析發(fā)現，墊狀卷柏SpLEA1與鷹嘴豆（XP_004506729.1）和紅車軸草（PNX91110.1）蛋白同源性較高，聚為一支（圖4）。

2.3 SpLEA1基因的啟動子克隆與功能元件分析

以墊狀卷柏DNA為模板，進行HiTail-PCR擴增SpLEA1基因啟動子序列，選擇第3泳道約為2 000 bp的條帶回收產物（圖5），克隆獲得SpLEA1起始密碼子（ATG）上游2 018 bp的序列。使用PlantCare在線軟件預測分析SpLEA1基因啟動子中的順式作用元件（圖6，表2），發(fā)現SpLEA1基因啟動子區(qū)含有核心啟動子TATA-box和啟動子增強子常見順式作用元件CAAT-box；含有光反應元件（I-box和G-Box）和大量與非生物脅迫有關的功能性順式作用元件，其中有激素類的脫落酸響應元件（ABRE）、茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）、赤霉素響應元件（GARE-motif和P-box）、水楊酸響應元件（TCA-element）及輔酶響應元件（TGA-element），還包含與干旱脅迫有關的功能性元件MYB及參與干旱誘導的MYB結合點（MBS）。根據以上結果可推測，SpLEA1基因的表達對墊狀卷柏在干旱環(huán)境下的生存能力有顯著影響。

2.4 SpLEA1基因qRT-PCR分析

利用qRT-PCR分析檢測墊狀卷柏SpLEA1在干旱脅迫下的表達模式。由圖7可知，在自然干旱時間延長的過程中，SpLEA1呈現上調表達趨勢，在干旱12 h時達到峰值，后呈現下降趨勢，在干旱24 h后給予復水處理2 h，SpLEA1的表達量顯著下降。根據以上結果可以推測，SpLEA1參與了墊狀卷柏干旱脅迫的響應。

3 討論與結論

在本研究中SpLEA1蛋白保守結構域為LEA-5（PF00477），屬于LEA1家族。與NCBI中已收錄的15個LEA蛋白進行序列對比，發(fā)現有2個保守序列在N端和C端出現，這與Battaglia 等（2008）的報道一致，在同源進化關系的分析中，沒有檢索到與SpLEA1蛋白相似度高的同屬植物，但發(fā)現墊狀卷柏SpLEA1與鷹嘴豆和紅車軸草的Lea-5蛋白同源性較高，而在研究鷹嘴豆中CarLEA793和CarLEA4基因在干旱脅迫下保護植物細胞的分子機制，推進了LEA蛋白的耐旱性研究（顧漢燕，2010）。 對大豆中LEA1蛋白結構研究表明，LEA1蛋白保守基序Em-C和Em-2M多肽在不同環(huán)境中的結構及聚集行為會發(fā)生改變，但都主要以無規(guī)則結構形式存在，這可能與Em蛋白在不同環(huán)境中的結構特點及其重要區(qū)域在整個蛋白中所起的作用有關（薛蓉等，2012）。鄒永東（2011）研究發(fā)現，LEA1蛋白在應對不同環(huán)境時可以形成不同的空間結構， 這些特殊的空間結構與α-螺旋相互作用，對細胞中的酶活性與蛋白質結構起到了保護作用。利用在線軟件SOPMA和Swiss-Model對SpLEA1蛋白的二級結構和三級結構進行分析預測，結果表明SpLEA1蛋白主要結構是α-螺旋和無規(guī)則卷曲，與LEA1家族基因的結構特點一致，推測SpLEA1蛋白通過形成α-螺旋與無規(guī)則結構參與對墊狀卷柏的干旱響應。在實時熒光定量結果分析中，可以看出SpLEA1基因在墊狀卷柏干旱處理后出現表達上調的趨勢，在干旱12 h時達到峰值，而在復水處理后表達量明顯下降，反映了SpLEA1蛋白在受到干旱脅迫時會被誘導表達，這可能是墊狀卷柏高耐旱性的原因之一。墊狀卷柏SpLEA1基因的時空表達差異為后續(xù)過表達功能研究提供了基礎。

本研究采用HiTail-PCR技術擴增SpLEA1基因啟動子序列， 利用在線軟件PlantCare分析墊狀卷柏SpLEA1基因啟動子中的順式作用元件，分析SpLEA1基因的轉錄表達水平，發(fā)現了核心元件TATA-box和CAAT-box，表明SpLEA1基因功能可以穩(wěn)定表達；對SpLEA1基因啟動子功能元件進行分析，結果表明啟動子區(qū)中含有大量的誘導型啟動子，包含5類激素誘導表達元件和非生物脅迫誘導表達元件，其中與水分脅迫有關的元件有7個ABRE、4個MYB和4個MYC，與實時熒光定量實驗中墊狀卷柏在干旱處理后SpLEA1基因表達上調的結果相一致，反映了SpLEA1基因參與了干旱脅迫的應答響應。但是，關于SpLEA1基因抗旱性的作用機制有待進一步研究。

本研究從墊狀卷柏中克隆獲得SpLEA1基因cDNA全長序列，通過對其蛋白結構分析得出SpLEA1蛋白為親水性穩(wěn)定蛋白。根據對SpLEA1基因啟動子的分離克隆和順式作用元件分析結果推測SpLEA1基因在墊狀卷柏耐旱機制中起作用，通過qRT-PCR表達實驗觀測到了在干旱環(huán)境中SpLEA1基因的高表達特性。因此，推測SpLEA1基因與墊狀卷柏的高耐旱性有關，并參與了墊狀卷柏在干旱脅迫下的表達調控。在后期的實驗中，可以構建SpLEA1基因在酵母或擬南芥中的高表達載體，驗證SpLEA1基因在原核和真核生物中的表達情況。對本研究的進一步探索可為植物抗旱基礎研究領域提供一定依據，提高園林園藝經濟觀賞植物在干旱環(huán)境下的生存率。

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（責任編輯 李 莉）

收稿日期：? 2022-03-03

基金項目：? 國家自然科學基金（31160177）。

第一作者： 周璇（1996-），碩士，主要從事植物分子生物學研究，（E-mail）974865841@qq.com。

通信作者：? 鄢波，博士，教授，博士研究生導師，主要從事分子生物方向研究，（E-mail）yanbodr@aliyun.com。