蓖麻RcMsc2基因功能分析

耿柳婷 李艷肖 張春蘭 于忠勇 王桂玲 向殿軍 劉鵬

摘 要：? G2/有絲分裂特異性細胞周期蛋白 2（G2/mitotic-specific cyclin-2，Msc2）作為高等植物應對逆境脅迫的關鍵調控蛋白，參與多個抗逆境脅迫的應答。為探究RcMsc2基因的功能，該研究從蓖麻葉片組織中成功克隆了RcMsc2，并利用生物信息學分析RcMsc2蛋白的結構和潛在功能，同時借助qRT-PCR方法分析RcMsc2基因的組織表達特性和非生物脅迫表達特性。結果表明：（1）RcMsc2基因位于蓖麻第5號染色體長臂，該基因的CDS（coding sequence）區是1 299 bp，編碼432個氨基酸。（2）RcMsc2蛋白擁有細胞周期（cyclin）家族特征結構域，是一個不穩定酸性親水蛋白，無跨膜域和信號肽，相對分子量為49.38 kD。（3）RcMsc2蛋白質的二級、三級結構以α-螺旋和無規則卷曲為主。（4）RcMsc2蛋白與麻風樹和巴西橡膠樹的CYCB2蛋白的序列同源性最高，且同被聚為Group Ⅱ。（5）35S-RcMsc2-GFP融合蛋白定位于細胞核。（6）RcMsc2基因在蓖麻的所有組織中均有表達且主要在根和莖中發揮作用；非生物脅迫分析表明RcMsc2基因可以被脫落酸（abscisic acid， ABA）、鹽、干旱和低溫處理誘導表達，并且RcMsc2基因對低溫脅迫的響應最敏感。綜上表明，該研究較全面地分析了RcMsc2基因的結構特征、系統進化和表達模式，為揭示RcMsc2基因在蓖麻的生長發育和應答冷脅迫過程中的功能提供了理論參考。

關鍵詞： 蓖麻， RcMsc2， 基因克隆， 表達特性， 冷脅迫

中圖分類號：? Q943

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2023）02-0336-11

Functional analysis of RcMsc2 gene in

castor（Ricinus communis）

GENG Liuting1， LI Yanxiao1， ZHANG Chunlan2， YU Zhongyong3，

WANG Guiling4， XIANG Dianjun1， LIU Peng1*

（ 1. College of Agriculture， Inner Mongolia Minzu University， Tongliao 028000， Inner Mongolia， China; 2. College of Life Sciences and Food

Engineering， Inner Mongolia Minzu University， Tongliao 028000， Inner Mongolia， China; 3. Inner Mongolia Hongbo Seed

Industry Technology Limited Company， Tongliao 028000， Inner Mongolia， China; 4. Zhalantun

Green Industry Development Center， Zhalantun 162650， Inner Mongolia， China ）

Abstract：? G2/mitotic-specific cyclin-2 （Msc2）， as a key regulatory protein in response to stress in higher plants， is involved in multiple responses to stresses. In order to explore the function of RcMsc2 gene which was successfully cloned from castor leaf tissue， the structure and potential function of RcMsc2 protein were analyzed by bioinformatics， and the expression characteristics of RcMsc2 gene in tissue and abiotic stress were analyzed by qRT-PCR. The results were as follows： （1） RcMsc2 gene was located in the long arm of Chromosome 5 in castor， and its CDS region was 1 299 bp， encoding 432 amino acids. （2） RcMsc2 protein has the characteristic domain of cyclin family， which was an unstable acidic hydrophilic protein without transmembrane domain and signal peptide， and its relative molecular weight was 49.38 kD. （3） The secondary and tertiary structures of RcMsc2 protein were mainly α-helix and random coil. （4） RcMsc2 protein had the highest sequence homology with CYCB2 protein of Jatropha curcas and Hevea brasiliensis， and was clustered into Group Ⅱ. （5）

35S-RcMsc2-GFP fusion protein was localized to the nucleus. （6） RcMsc2 gene was expressed in all tissues of castor， and mainly played a role in roots and stems; abiotic stress analysis showed that RcMsc2 gene could be induced by abscisic acid （ ABA ）， salt， drought and low temperature treatment， and the response of RcMsc2 gene to low temperature stress was the most sensitive. In summary， this study comprehensively analyzed the structural characteristics， phylogenetic evolution and expression patterns of RcMsc2 gene， and provides a theoretical reference for revealing the function of RcMsc2 gene in castor growth and development and response to cold stress.

Key words： castor， RcMsc2， gene cloning， expression characteristics， cold stress

蓖麻（Ricinus communis）是一種產于非洲的大戟科多年生草本植物，可以在熱帶和溫帶地區種植（Maghuly et al.， 2015）。因蓖麻油中含有豐富的蓖麻油酸，現已被列為第二代生物質綠色能源的重要原料（Trabelsi et al.， 2018）。蓖麻擁有極強的抗旱和耐鹽堿能力，可以在較貧瘠的土地上生長，但在苗期易受細菌感染和冷脅迫的危害，最終導致植株成活率降低和籽粒品質下降（Severino et al.， 2012; Wang et al.， 2022）。內蒙古通遼位于中緯度地區，在作物的生長期這里平均最低氣溫最高為16.1 ℃，最低僅有12.7 ℃，這種低溫環境嚴重影響著蓖麻種子的萌發、生長和生物量的積累（Tao et al.， 2020）。因此，如何改善低溫環境對蓖麻生長發育的影響并選育出多抗非生物逆境脅迫的新品種，對未來的蓖麻種植產業及滿足工業對蓖麻油的需求具有重要意義。

細胞分裂是生物生長發育中最基本的過程（van Leene et al.， 2010）。真核細胞的細胞周期進程主要是由細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的蛋白激酶家族控制（Suryadinata et al.， 2010）。根據生物體的類別不同，細胞周期蛋白也根據它們在細胞周期中發揮作用的階段分為細胞周期蛋白M和細胞周期蛋白G1（Canaud et al.， 2019）。G1周期蛋白包括C、D、E和G共4種類型以調節G1-S轉換，M周期蛋白包括A和B共2種類型，可以在S-M轉變、G2-M過渡階段和M階段內起作用（Kivomgi et al.， 2011）。G2/有絲分裂特異性細胞周期蛋白-2（G2/mitotic-specific cyclin-2，Msc2）屬于B型細胞周期蛋白，可通過在G2期到M期的轉變、G2期內和M期內的短暫時間內表達以響應環境變化（Hégarat et al.， 2020）。最近研究發現，CYCB2基因可能參與植物的鹽脅迫、重金屬脅迫、脫落酸（abscisic acid， ABA）和冷脅迫下的表達（Hu et al.， 2010; Xu et al.， 2010; Huang et al.， 2013; Fan et al.， 2022），煙草（Nicotiana tabacum）NtCycB2基因隨著NaCl處理時間的延長表達量減少，而敲除NtCycB2基因可以提高植株在NaCl脅迫下的抵抗力（Yan et al.， 2021）；高粱（Sorghum bicolor）的轉錄組研究發現CYCB2基因在100 μmol·L-1和150 μmol·L-1鎘（Cd）金屬離子脅迫下表達量均為上升趨勢，說明高粱的CYCB2基因可能參與抗重金屬脅迫調控機制（Roy et al.， 2016）；擬南芥atl17突變株與野生型植株相比，在ABA不同濃度梯度處理下，CYCB2;1在atl17的表達量顯著高于WT，表明可能通過ABA調控機制抑制主根的生長而抵御逆境（Xu et al.， 2010）；甘藍（Brassica oleracea）的冷脅迫試驗表明，CYCB2基因在2 d和7 d的表達模式差異顯著，CYCB2;1、CYCB2;2、CYCB2;3和CYCB2;4的Log2值均高于對照，但處理7 d的CYCB2表達量顯著低于2 d的，表明CYCB2基因可以在冷脅迫的短期內提高植株的細胞分化能力來減輕冷脅迫帶來的傷害（

AC＇U1osic＇ et al.， 2019）。但是，CYCB2基因在蓖麻中的潛在功能及調控機制研究較少，而蓖麻作為重要的生物原料，研究其抗逆機制就顯得尤為重要。

蓖麻轉錄組數據中表達上調的DEGs有848個，而RcMsc2（XP_002521704.1）在低溫（相較于適溫25 ℃）下的表達顯著上調，并且作為擬南芥CYCB2;3的同源基因，很可能在蓖麻的冷適應過程中發揮作用（白雪等，2019）。因此，我們克隆了RcMsc2基因，用煙草葉片細胞明確RcMsc2基因的亞細胞位置，并通過qRT-PCR技術分析其在不同脅迫下的表達模式。本研究旨在探討以下問題：（1）RcMsc2蛋白理化性質、結構及物種間的進化關系；（2）蓖麻RcMsc2基因的組織表達模式及非生物脅迫下的表達模式；（3）蓖麻RcMsc2在冷脅迫過程中的潛在功能。本研究可為蓖麻的抗低溫育種提供潛在的基因資源，同時也可為解析蓖麻RcMsc2基因在應對冷脅迫方面的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘通篦5號由通遼市農牧科學研究所提供。植物總RNA提取試劑盒（MonzolTM Reagent）、反轉錄試劑盒（MonScriptTM RTIII All-in-One Mix with dsDNas）購自莫納生物公司。T-載體（pMDTM 18-T vector）、限制性內切酶（Bsa I）和DNA連接試劑盒（DNA Ligation Kit）購自寶日醫生物公司。高保真PCR酶（KOD Master Mix）、PCR產物回收和純化試劑盒購自天根生化科技有限公司。Maxima Reverse Transcriptase和2X SG Fast qPCR Master Mix購自賽默飛世爾科技（上海）公司。大腸桿菌感受態（DH5α）、保真酶（2×Taq Master Mix）、引物合成和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 材料處理

將健康的蓖麻種子消毒后置入適量的無菌水中，于30 ℃催芽3 d。出芽后將其平均分成4份，并整齊地擺放在水培盤中，待2片子葉展開后開始澆灌1/4 Hoagland溶液，每日補充200 mL。當幼苗長至4葉齡時，剪取幼苗的組織（根、莖、子葉和真葉）以檢測RcMsc2基因的組織表達量；然后分別對其進行4 ℃、150 mmol·L-1 NaCl、10% PEG 6000和100 μmol·L-1 ABA脅迫，經時間梯度（0、2、4、8、12、24、30、48 h）處理后采集幼苗的真葉并迅速存于液氮中，冷凍24 h后轉移至-70 ℃冰箱備用。

1.3 RcMsc2基因的克隆

1.3.1 總RNA提取和第一鏈cDNA的合成 參照MonzolTM Reagent試劑盒的說明書操作步驟，提取4 ℃處理12 h的蓖麻組織的總RNA，并檢測純度。以提取的RNA作為模板，參照MonScriptTM RTIII All-in-One Mix with dsDNas試劑盒說明書反轉錄合成第一鏈cDNA，作為克隆RcMsc2基因的模板。

1.3.2 RcMsc2基因的克隆及測序 根據NCBI數據庫公布的RcMsc2基因（XP_002521704.1）的CDS區設計引物RcMsc2-F|RcMsc2-R（表1）。以蓖麻cDNA為模板，使用高保真酶（KOD Master Mix）擴增RcMsc2基因的CDS序列，PCR擴增反應程序：94 ℃預變性4 min; 94 ℃變性30 s， 58 ℃退火45 s， 72 ℃延伸90 s， 35個循環; 最后延伸10 min。經電泳檢測后將符合大小的片段回收，在3′端加A堿基后利用DNA純化試劑盒純化產物后連接至T載體，將pMDTM 18-T-RcMsc2熱擊轉化DH5α，在Kan+培養基上篩選出陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 RcMsc2蛋白質的生物信息學分析

借助ExPASy（https：//web.expasy.org/translate/）工具將RcMsc2基因的編碼序列翻譯成蛋白序列。在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下載蓖麻的全基因組、蛋白組和注釋文件，將RcMsc2蛋白作為靶序列進行本地BLASTp，以明確RcMsc2基因的具體位置。使用蛋白分析網站ExPASy-PROSITE（https：//prosite.expasy.org）分析RcMsc2蛋白質的理化性質和親水/疏水性。借助NCBI-CD-SEARCH（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）、PSORT（http：//psort.hgc.jp/）和Motif Scan（https：//myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan/）工具分別預測蛋白的結構域、亞細胞位置和生物活性位點。使用在線工具SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）、DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）和Motif Scan（https：//myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan）分別預測該蛋白的信號肽、跨膜域和生物活性位點。利用UniprotKB數據庫（https：//www.uniprot.org/help/uniprotkb）在線BLASTp程序下載RcMsc2蛋白質的同源序列，使用ClustalW和MEGA 11.0軟件對下載的序列進行比對及可視化分析，將多序列比對結果提交至ENDscript/ESPript（https：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）網站進行美化并將進化樹提交至iTOL（https：//itol.embl.de）網站進行美化。蛋白質的二級結構在SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）進行可視化預測。將RcMsc2蛋白質提交至SWISS-MODLE（https：//swissmodel.expasy.org/）預測其三級結構并借助SAVES v6.0（https：//saves.mbi.ucla.edu/）工具對預測模型打分，檢測合格后對其蛋白質的三級結構進行分析。

1.5 RcMsc2基因的表達分析

根據RcMsc2基因的CDS序列設計qRT-PCR引物RcMsc2-Fx|RcMsc2-Rx（表1），以RcActin（NC_063262.1）基因作為內參基因，分析RcMsc2基因的組織表達模式及脅迫處理下的表達模式。以Trizol法提取蓖麻組織的總RNA，并反轉錄成單鏈cDNA作為PCR擴增的模板，嚴格按照2X SG Fast qPCR Master Mix的說明書操作步驟，在LightCycler480 Ⅱ型PCR儀上完成對基因的擴增。反應程序：預變性95 ℃ 3min，變性95 ℃ 5 s，退火和延伸60 ℃30 s，45個循環。用2 -（ΔΔCt）法計算RcMsc2基因的相對表達量。

1.6 RcMsc2蛋白質亞細胞定位

使用限制性酶Bsa I對pCAMBIA2300-CaMV 35S-GFP進行酶切后回收目的片段。將pMDTM 18-T-RcMsc2作為重組DNA的模板，擴增引物為RcMsc2-GFP-Fx|RcMsc2-GFP-Rx。使用KOD Master Mix先將模板序列連接在pKY-35S-GFP載體上，再將產物轉化至DH5α感受態細胞，最后篩選出陽性克隆并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。確認測序結果正確后將pKY-35S-RcMsc2-GFP載體轉至農桿菌中，最終在煙草葉片的表皮細胞中瞬時表達以確定RcMsc2基因的亞細胞位置。

2 結果與分析

2.1 RcMsc2基因的克隆

根據前期轉錄組數據信息，提取蓖麻葉片總RNA，質量符合反轉錄操作要求（圖1：A）。并以cDNA為模板進行目的基因的擴增，得到大約1 300 bp的條帶（圖1：B），并經過T-A克隆、轉化、陽性菌落的克隆和測序，得到1 299 bp的ORF，推導其編碼為432個aa（圖2），并命名為RcMsc2，本地BLASTp檢索發現其定位在第5號染色體長臂。

2.2 RcMsc2蛋白的生物信息學分析

2.2.1 RcMsc2蛋白的基本理化性質分析 Protparam工具預測結果顯示，RcMsc2蛋白的分子式為C2186H3426N584O662S28，共計6 886個原子，相對分子質量為49.38 kD，理論等電點為5.26，說明RcMsc2蛋白呈酸性；該蛋白由20種氨基酸組成，其中谷氨酸（Glu）數量最龐大，占總數的9%，而色氨酸（Trp）數量最少，僅占總數的0.7%，帶負電荷的氨基酸（Asp + Glu）有60個，帶正電荷的氨基酸（Arg + Lys）有46個（圖2）；不穩定系數為45.24（＞40閾值），表明該蛋白是不穩定蛋白；總平均疏水性為-0.353（＜0），預測該蛋白是親水蛋白；蛋白的脂肪指數為81.69。另外，RcMsc2蛋白擁有一個Cyclin_C（pfam ID： PF02984）結構域和一個Cyclin_N（pfam ID： PF00134），是B型細胞周期蛋白（cyclin）家族的一員（圖3）。

2.2.2 RcMsc2蛋白的多序列對比及同源性分析 采用線上BLAST比對發現，麻風樹（Jatropha curcas，XP_012065375.1）、巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis，XP_021645034.1）、柳樹（Salix suchowensis，XP_024456907.1）、可可樹（Theobroma cacao，EOX90682.1）、榴蓮（Durio zibethinus，XP_022740327.1）、棉花（Gossypium mustelinum，TYI88728.1）、大豆（Glycine max，NP_001352035.1）和豇豆（Vigna angularis，XP_014521177.1）與該蛋白的序列一致性依次是87.4%、85.5%、81.1%、79.7%、79.7%、77.5%、72.7%和72.7%，表明細胞周期蛋白在物種間高度保守，特別是N端蛋白的一致性較高，說明不同物種間的蛋白功能可能相似（圖4）。另外，位于結構域內部的第283位氨基酸是細胞周期蛋白底物特異性位點，RcMsc2蛋白是E（谷氨酸），而其他植物是K（賴氨酸），這可能導致蓖麻RcMsc2蛋白與其他植物的CYCB2蛋白擁有不同的底物特異性。MEGA 11.0中鄰接法構建的進化樹結果顯示（圖5），8種植物的細胞周期蛋白共被聚為3類。同處于Group Ⅰ大豆和豇豆的蛋白在進化中鈍化，步長值為100%；Group Ⅱ中蓖麻與麻風樹和巴西橡膠樹的步長值為99.9%，與多序列比對結果相同；Group Ⅲ中棉花與榴蓮和可可樹的步長值為100%。Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅲ分別對應豆科、大戟科和錦葵科植物，足以說明此進化樹構建結果準確，表明CYCB2蛋白在物種間的進化高度保守。因此，RcMsc2蛋白與麻風樹和巴西橡膠樹的序列一致性最高，親緣關系最近。

2.2.3 RcMsc2蛋白的信號肽、跨膜域及生物活性位點預測 SignalP 5.0預測RcMsc2蛋白中存在信號肽的可能性是0.001 2，推測該蛋白中無信號肽結構。DeepTMHMM預測結果顯示，RcMsc2蛋白的432個氨基酸殘基上均無從外到內的跨膜域，因此推測RcMsc2蛋白不具備跨膜能力。Motif Scan預測顯示在RcMsc2蛋白內部有6個潛在的N-糖基化位點（分別位于第2～第5位、第189～第192位、第303～第306位、第370～第373位、第378～第381位和第411～第414位氨基酸），4個潛在的酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（分別位于第63～第66位、第142～第145位、第337～第340位和第419～第422位氨基酸），3個潛在的肉豆蔻基N-肉豆蔻酰化位點（分別位于第20～第25位、第48～第53位和第61～第66位氨基酸）和7個潛在的蛋白激酶C磷酸化位點（分別位于第82～第84位、第100～第102位、第280～第282位、第322～第324位、第400～第402位、第412～第414位和第418～第420位氨基酸），共20個生物活性位點。這些位點的預測為解釋RcMsc2蛋白在逆境中功能提供理論基礎。

2.2.4 RcMsc2蛋白的高級結構預測

分析RcMsc2蛋白質的二級、三級結構，可為蛋白功能研究提供基礎支撐。RcMsc2蛋白質的二級結構預測結果（圖6）顯示，它是由52.55%的α-螺旋、40.51%的無規則卷曲、5.79%的延伸鏈和1.16%的β-轉角共同構成。從RcMsc2蛋白質的三級結構預測圖（圖7：A）中可以看出，RcMsc2蛋白主要由α-螺旋構成。SAVES v6.0模型檢測工具結果（圖7：B）顯示，編碼RcMsc2蛋白的432個氨基酸殘基中有91.1%位于core區域（紅色區域 > 90%，A、B、L區），8.9%位于次允許區域（a、b、l、p區），表明SWISS-MODEL預測的此蛋白質三級結構模型具有可靠性。

2.3 RcMsc2蛋白的亞細胞定位分析

PSORT預測RcMsc2蛋白的亞細胞定位在細胞核的可能性最大。因此，為了驗證RcMsc2蛋白亞細胞的具體位置，成功構建了由農桿菌（GV3103）介導的pCAMBIA2300-CaMV 35S-RcMsc2-GFP表達載體，并在煙草表皮細胞中瞬時表達。結果（圖8）顯示，35S-GFP的綠色熒光蛋白在細胞核、細胞質和細胞膜中均有分布（圖8：A-D），而35S-RcMsc2-GFP中熒光蛋白則主要分布在細胞核和細胞膜（圖8：E），將結果合并后，疊加場中的35S-RcMsc2-GFP主要在煙草葉片的細胞核和細胞膜處有綠色熒光，但RcMsc2定位在細胞核的可能性較大，與PSORT預測結果一致，可為后續證明RcMsc2蛋白的抗逆功能提供依據。

2.4 RcMsc2基因的表達特征分析

2.4.1 RcMsc2基因的組織表達模式分析 采用qRT-PCR技術分析RcMsc2基因在蓖麻不同組織中的表達水平（圖9）。結果發現，RcMsc2基因在種子和幼苗期均有表達，呈顯著差異（P<0.05）。其中，RcMsc2基因在根中的表達量顯著高于其他組織，表達量分別是子葉、莖、真葉的2.13、14.11、14.94倍。這表明RcMsc2基因擁有明顯的組織表達特異性，并且有可能在根和莖中表達以抵御不利環境。

2.4.2 RcMsc2基因的非生物脅迫表達模式分析 采用qRT-PCR方法， 研究蓖麻幼苗葉片的RcMsc2基因在低溫（4 ℃）、高鹽（150 mmol·L-1 NaCl）、脫落酸（100 μmol·L-1 ABA）和干旱（10% PEG 6000）脅迫下的表達特征。結果顯示，RcMsc2基因在不同脅迫下隨著時間梯度而差異表達（圖10），呈現出不同的表達模式。RcMsc2基因積極應答鹽脅迫和干旱脅迫，分別在2 h和4 h開始表達，且均在4 h出現峰值，表達量分別是對照組（0 h）的3.09倍和4.82倍（圖10：B，D）；RcMsc2基因在低溫和ABA處理下呈延遲表達模式，均在12 h出現最大值， 而ABA脅迫12 h后RcMsc2的表達量驟降，表明RcMsc2基因在低溫條件下的表達可能經ABA激活而持續表達至48 h，說明RcMsc2可能是一個冷誘導基因，并且延遲12 h后才被激活表達。

3 討論與結論

細胞周期蛋白與CDKs復合以控制CDKs的活性、底物和亞細胞位置，在植物細胞周期的細胞分裂過程中發揮著極其重要的作用（Loyer & Trembley.， 2020），而CYCB2蛋白主要在G2期發揮作用（Aydinoglu， 2020）。CYCB2基因隸屬于多基因家族，在大豆（Fonseca-García et al.， 2021）、苜蓿（Meng et al.， 2020）和擬南芥（Sterken et al.， 2012）的基因組中分別有13、12和11個CYCB2基因，并且都含有相同的結構域，即Cyclin_C和Cyclin_N，且已有相關功能方面的研究，而關于蓖麻的Msc2蛋白功能研究較少。因此，本研究根據蓖麻低溫轉錄組數據克隆出RcMsc2基因，發現其推導出432個氨基酸， 雖然蛋白長度短于擬南芥CYCB2;3（van Leene et al.， 2010），但明顯長于苜蓿的MedtrCycB1;2、MedtrCycB2;1和MedtrCycB2;2蛋白（Meng et al.， 2020）。RcMsc2蛋白的理化性質與大豆（Fonseca-García et al.， 2021）、苜蓿（Meng et al.， 2020）、番茄（Anwar et al.， 2019）和高粱（Roy et al.， 2016）等的細胞周期蛋白存在一定差異，這可能是導致不同物種的細胞周期蛋白參與不同逆境的直接原因。RcMsc2蛋白的序列特征分析表明，該蛋白主要由α-螺旋組成且是一個親水蛋白，無信號肽結構，這與前人研究結果一致（Lara-Núez et al.， 2015; Sui et al.， 2016）。

研究發現，高等植物的蛋白肉豆蔻酰化修飾可以幫助其應對多種不利環境（Ishitani et al.， 2000; Podell & Gribskov， 2004）。然而，受環境誘導表達的蛋白并非單獨起作用，而是多個蛋白共同協作，從而提高植株在逆境中的活力（豆玉娟等，2014）。RcMsc2蛋白存在3個N-肉豆蔻酰化作用位點，極有可能在低溫下誘導與低溫相關的蛋白來共同合作來抵御低溫環境，進而提高蓖麻植株在低溫環境下的存活能力。研究顯示，CYCB2蛋白在細胞核（Sabelli et al.， 2014）、紡錘體（Bulankova et al.， 2013）、內質網、細胞質和細胞膜（Boruc et al.， 2010a）中均有分布，而CYCB2型蛋白則主要定位在細胞核

（Lara-Núez et al.， 2021; Chun et al.， 2021），并會根據環境的不同來調整位置以適應逆境（Boruc et al.， 2010b），RcMsc2蛋白的亞細胞定位結果表明，該蛋白明顯定位在細胞核，并且作為一個核蛋白，極可能在冷脅迫過程中發揮著重要作用。

研究顯示，植物的CYCB2基因家族成員在應對多逆境脅迫時可以激發各種防御機制來提高植株的存活率（Huang et al.， 2020; Zhang et al.， 2021）。同時，該家族成員還擁有明顯的脅迫表達時空特異性，高粱的CYCB2基因的表達與Cd濃度呈顯著正相關，即在100 μmol·L-1 Cd處理下的表達量顯著低于150 μmol·L-1（Roy et al.， 2016）；甘藍的4個CYCB2基因（CYCB2;1～CYCB2;4）在冷處理2～7 d基因表達量相似，均在第2天表達出現峰值（AC＇U1osic＇ et al.，? 2019）。RcMsc2基因在ABA、PEG、4 ℃和NaCl脅迫下的葉片中均有表達，而該基因在高鹽和干旱脅迫下的表達模式相仿，均在處理的前4 h就已經表達并出現峰值，RcMsc2基因在脫落酸和低溫處理下呈延遲表達模式，其中該基因在低溫環境下持續表達至48 h，表明該基因是一個冷調控基因，并且極有可能被ABA激活，說明該基因響應多環境壓力的誘導，但其對低溫的響應時間更持久。另外，細胞周期蛋白家族基因成員還有明顯的組織表達特異性，擬南芥（Arabidopsis thaliana）突變株（gig1和uvi4）內的CYCB2;2和CYCB1;1在子葉和下胚軸中擁有明顯的組織表達特異性，并且可能在地塞米松（dexamethasone）的誘導下在下胚軸中起作用（Iwata et al.， 2012）。本研究表明，蓖麻RcMsc2基因在種子期與幼苗期均有表達，并且擁有明顯的組織表達特異性，該基因極大可能在低溫環境下在蓖麻的莖和葉中發揮作用，但在不同組織中調控機制還需深入探索。因此，本研究為蓖麻RcMsc2基因在應答冷脅迫方面的分子機制提供了參考。

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（責任編輯 李 莉 王登惠）

收稿日期：? 2022-08-24

基金項目：? 國家自然科學基金（31860389，32060492）； 內蒙古自治區自然科學基金（2022MS03057，2020LH03006）。

第一作者： 耿柳婷（1997-），碩士研究生，研究方向為作物遺傳改良與種質創新，（E-mail） 2214883304@qq.com。

通信作者：? 劉鵬，博士，教授，研究方向為作物遺傳育種，（E-mail） mindaliupeng@126.com。