基于擴增子和宏基因技術(shù)探討去卵巢大鼠腸道菌群的變化

丁冰倩，徐琳琳，王雪嫄，趙欣，王艷，傅金英，2

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450002；2.河南省中醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450053

圍絕經(jīng)期是婦女自生育期的規(guī)律月經(jīng)過渡到絕經(jīng)的時期，此期主要表現(xiàn)為月經(jīng)不規(guī)則、生殖器官萎縮、烘熱汗出、情緒不穩(wěn)定、血壓易波動等，這些臨床表現(xiàn)被稱為圍絕經(jīng)期綜合征（perimenopausal syndrome, PMS）[1]。隨著我國老齡化社會的到來，人口平均壽命的增加，大部分女性絕經(jīng)后還要生存很長一段時間，她們絕經(jīng)后的身心健康和生存質(zhì)量值得引起廣泛關(guān)注。

腸道菌群是人體最重要、最龐大的微生態(tài)系統(tǒng)，其基因組總和比人類多100倍[2-3]，機體的胃腸道中定植著大量的菌群，腸道菌群在機體代謝過程中起著重要作用，被稱為“代謝器官”[4]。腸道菌群與機體互利共生，參與機體的脂質(zhì)代謝以及機體免疫，并且腸道菌群的改變能夠影響脂質(zhì)和膽固醇的代謝，進而影響機體疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。作為人體組成部分之一的腸道菌群，與PMS關(guān)系密切，可能和腸道有益菌群與腐敗菌群比例發(fā)生變化有關(guān)[6]。

本研究旨在從去卵巢大鼠模型出發(fā)，通過去卵巢大鼠模型模擬圍絕經(jīng)期女性，探討圍絕經(jīng)期大鼠與正常大鼠腸道菌群的差異，為臨床認識及治療PMS提供參考價值。

1 材料和方法

1.1 材料 12 只8 周齡SPF級SD雌性大鼠，購自華興實驗動物養(yǎng)殖場[動物許可證編號：SCXK（豫）2019-0002]，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)中心實驗室；麻醉用品：水合氯醛（天津大茂化學(xué)試劑廠）；造模術(shù)后抗感染藥物：注射用青霉素鈉（160萬IU，國藥準字：H13020655，華北制藥股份有限公司）。ELISA試劑盒；全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技，設(shè)備型號：chemray240）；核酸電泳儀（北京六一儀器廠，設(shè)備型號：DYCP-32C型瓊脂糖水平電泳儀）。Covaris超聲波破碎儀（Massachusetts，美國；設(shè)備型號：Covaris S2 system）。Qubit Fluorometric Quantification（Life Technologies，CA，美國；設(shè)備型號：Qubit 2.0）。生物分析儀（美國安捷倫公司；設(shè)備型號：Agilent 2100）。PCR儀（Bio-Rad，美國；設(shè)備型號：T100PCR）。測序儀（Illumina，San Diego，CA，美國；設(shè)備型號：Novaseq 6000）。

1.2 造模方法 12只SPF級SD雌性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，術(shù)前禁食不禁水12 h，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，沿大鼠下腹正中切開，沿Y形子宮找卵巢，隨機摘除6只大鼠雙側(cè)卵巢并止血，將子宮、輸卵管等放回腹腔，縫合。術(shù)后腹腔注射青霉素鈉每天20萬IU/只，連續(xù)3 d。實驗動物處置符合河南中醫(yī)藥大學(xué)頒布的實驗動物倫理學(xué)標準（審查編號：PZHNSZYY-2021-032）。模型復(fù)制成功后，將12只大鼠分為2組，對照組（未做任何處理）和模型組（去除雙側(cè)卵巢）置于同一實驗環(huán)境中喂養(yǎng)3周。

1.3 觀察指標

1.3.1 實驗大鼠體質(zhì)量：將2組實驗大鼠進行3周的喂養(yǎng)，每日稱體質(zhì)量，并計算造模前1天和造模3周后的體質(zhì)量，對比2組間有無差異。

1.3.2 糞便標本采集及腸道菌群的檢測：實驗動物術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)3 周，活體進行大鼠糞便的采集。采集糞便時先進行大鼠肛周消毒，輕輕擠壓大鼠尾巴根部直腸末端，待糞便排出收集于無菌EP管中，-80 ℃保存。16S rDNA高通量測序技術(shù)和宏基因測序技術(shù)對樣本菌群組成進行分析。測序技術(shù)均由深圳微科盟科技集團有限公司提供。

1.3.3 實驗大鼠血清指標檢測：將實驗大鼠喂養(yǎng)3周后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，解剖實驗大鼠，進行大鼠腹主動脈采血，分離血清，采用ELISA試劑盒檢測卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone, FSH）、雌二醇（estradiol, E2）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS27.0軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量資料采用±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，腸道菌群采用秩和檢驗、Permanova分析等進行統(tǒng)計學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠體質(zhì)量 造模前，模型組和對照組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義[（208.8±4.5）gvs.（208.2±6.2）g，t=-0.212，P=0.836]。造模術(shù)后7 d內(nèi)模型組體質(zhì)量低于對照組，之后模型組體質(zhì)量逐漸增加，術(shù)后第3周模型組大鼠體質(zhì)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（267.3±16.6）gvs.（305.2±24.6）g，t=3.120，P=0.011]。見圖1。

圖1 兩組大鼠體質(zhì)量對比

2.2 實驗大鼠FSH、E2水平 與對照組比，模型組大鼠血清FSH水平顯著升高[（12.57±4.88）IU/Lvs.（38.03±6.40）IU/L，t=7.752，P＜0.001]，E2水平顯著降低[（16.17±4.67）pmol/Lvs.（7.31±4.05）pmol/L，t=-3.511，P=0.006]。

2.3 基于16s rRNA對大鼠腸道菌群分析

2.3.1 大鼠腸道菌群共有物種分析：在樣本中，根據(jù)物種是否存在來尋找分組之間的特有或共有的物種，我們繪制韋恩圖分析不同樣品組之間特有或共有的物種，通過對兩組符合檢測要求的樣品的腸道菌群進行16S rDNA分析，兩組共有物種為518個操作分類單位（operational taxonomic units, OTU），對照組特有物種為972個OTU，模型組特有物種為1 411個OTU。

2.3.2 Alpha多樣性指數(shù)稀釋性曲線：曲線以橫坐標代表樣本數(shù)目，縱坐標代表測序深度，物種累積曲線可以對測序深度是否充足進行判斷，箱形圖位置急劇上升表明是測序深度不夠，需要增加測序深度，可以發(fā)現(xiàn)更高物種多樣性；箱形圖位置趨于平穩(wěn)，則表示測序深度足夠，可以進行數(shù)據(jù)分析。如圖2結(jié)果顯示，曲線末端上升趨勢趨于平緩，說明本研究測序深度充足，足以涵蓋整個群落結(jié)構(gòu)。

圖2 Alpha多樣性指數(shù)稀釋性曲線

2.3.3 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計分析：Alpha多樣性指數(shù)通常用chao1、Observed_OTUs、Shannon、simpson等指數(shù)來評估樣本的物種多樣性，指數(shù)越高，表明樣本的多樣性越復(fù)雜。從對照組到模型組，物種多樣性呈下降態(tài)勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明組內(nèi)腸道菌群的物種組成差異不大，見圖3。

圖3 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計分析

2.3.4 Beta多樣性指數(shù)統(tǒng)計分析：主成分分析（principal component analysis, PCoA）見圖4，PC1：PC2表示對總體方差解釋的百分比（21.1%：15.7%），組間Permanova差異分析顯示，對照組和模型組間的物種結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002），說明去卵巢前后腸道菌群物種結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。

圖4 樣本Beta多樣性指數(shù)分析

2.4 基于宏基因?qū)δc道菌群物種多樣性觀察

2.4.1 對腸道菌群種水平的觀察：在種水平，對照組與模型組相比，兩組間豐度前20 物種在羅伊氏乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri，對照組9.7%，模型組1.9%，Z=-2.082，P=0.037）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，對照組4.7%，模型組0.04%，Z=-2.562，P=0.010）、未分類普雷沃氏菌（unculturedPrevotellasp.，對照組4.6%，模型組0.03%，Z=-2.882，P=0.004）種差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 種水平上腸道菌群相對豐度（前20的物種）

2.4.2 功能數(shù)據(jù)庫注釋（KEGG）

2.4.2.1 功能相對豐度概況：在KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫中，Level 1 層級中兩組沒有差異有統(tǒng)計學(xué)意義的功能（P＞0.05），見圖6A。在level 2層級上，碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）通路中的功能基因表達較高，見圖6B。

圖6 不同層級功能相對豐度概況

2.4.2.2 功能相對豐度差異性分析：在Level 3水平（見圖7），基于KEGG數(shù)據(jù)庫，我們通過線性判別分析法（LEfSe，LDA＞2，P＜0.05）確定了兩組中代謝通路的差異豐度，每橫向柱代表一個通路，柱形的顏色對應(yīng)分組的特征代謝通路ID，柱形的長度對應(yīng)LDA值[8]。兩組間共鑒定出27個豐度相對較高的代謝通路。模型組顯著富集在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（map00400）、脂多糖生物合成（map00540）、泛酸鹽和輔酶A生物合成（map00770）、新生霉素生物合成（map00401）、果糖和甘露糖代謝（map00051）、細胞凋亡（map04210）等通路。對照組顯著富集在酮體的合成與降解（map00072）、牛磺酸和低牛磺酸代謝（map00430）、萘降解（map00626）、脂肪酸降解（map00071）、芳香族化合物的降解（map01220）等通路。

圖7 KEGG的基本代謝通路LEfSe分析LDA柱形圖

KO（KEGG Orthologous groups）LefSe組間差異比較結(jié)果顯示，模型組在脂多糖生物合成通路中顯著富集，說明注釋到的功能基因在這通路中占據(jù)優(yōu)勢。脂多糖生物合成通路中模型組lpxA、lpxK和kdsB特征基因大部分來自Bacteroides vulgatus、Akkermansia muciniphila、Bacteroides dorei、Bacteroides massiliensis、Parabacteroidesdistasonis、Alistipes senegalensis，lpxA、lpxK也來源于Bacteroides xylanisolvens，kdsB也來源于Escherichia coli。見圖8。

圖8 特征基因分層柱狀圖

3 討論

圍絕經(jīng)期是女性由中年步入老年的必經(jīng)階段，在此期間，由于卵巢功能衰退，體內(nèi)雌激素水平急劇下降，導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，從而增加了代謝綜合征（metabolism syndrome，MS）的發(fā)生率[9-10]。MS可顯著增加心血管疾病和糖尿病的患病風(fēng)險[11]。吳立等[12]研究發(fā)現(xiàn)，圍絕經(jīng)期的女性容易發(fā)生糖脂代謝紊亂。本課題組前期的動物實驗和臨床實驗研究也證實，圍絕經(jīng)期易出現(xiàn)體質(zhì)量增加、脂代謝紊亂等問題[13-14]，但其作用機制尚不明確。

腸道菌群是宿主代謝的重要調(diào)節(jié)因子之一，宿主和腸道菌群可以相互作用。研究顯示[15]，腸道菌群的變化與人體衰老相關(guān)，而在圍絕經(jīng)期這一由中年至老年的過渡時期，無論圍絕經(jīng)期女性是否有明顯自覺不適癥狀，均需對她們的健康進行科學(xué)管理，以杜絕和減緩未來危害生命和生存質(zhì)量的重大疾病的發(fā)生率。本研究通過模型組大鼠體質(zhì)量顯著高于對照組和實驗大鼠血清學(xué)結(jié)果，來證明本實驗造模方法的可行性。基于16S rDNA對大鼠腸道菌群進行分析，韋恩圖顯示兩組間物種組成差異較大，但是模型組較對照組特有物種多，這一結(jié)果有待后續(xù)進一步研究。腸道菌群物種多樣性觀察中，Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計分析顯示去卵巢前后腸道菌群的物種組成差異不大。Beta多樣性指數(shù)基于Bray Curtis距離來進行PCoA分析，兩組間的物種組成差異較大；然后對組間菌群進行Permanova分析，表明去卵巢前后大鼠的腸道菌群多樣性存在顯著差異。

宏基因技術(shù)將腸道菌群注釋到種水平，與對照組相比，模型組Limosilactobacillus reuteri、Lactobacillus acidophilus和unculturedPrevotellasp.豐度顯著下降。相關(guān)研究顯示[16-20]，Limosilactobacillus reuteri可以增加能量消耗、預(yù)防肥胖，并且可以降脂、降糖、抗炎、增強胰島素敏感性。Prevotella為普雷沃氏菌，其豐度與脂多糖呈負相關(guān)，肥胖患者腸道中其物種豐度較低[21]。

MS與氧化應(yīng)激升高之間存在很強的相關(guān)性。氧化應(yīng)激是指機體在缺血、缺氧等不利因素的作用下，因活性氧濃度過高而導(dǎo)致細胞凋亡和組織損傷的病理生理反應(yīng)，是心血管疾病、MS、心肌缺血和心肌梗死等一系列疾病的危險因素[22]。乳桿菌可以提高總抗氧化能力，并與胰島素敏感性負相關(guān)[23]，且與葡萄糖、總膽固醇和甘油三酯呈負相關(guān)，可抑制代謝炎癥和促進能量消耗[24-25]。本研究結(jié)果顯示，在種水平，絕經(jīng)前大鼠腸道菌群較絕經(jīng)后大鼠相比具有顯著差異，這不僅為模型組大鼠體質(zhì)量顯著增加提供依據(jù)，還可通過研究絕經(jīng)后大鼠的腸道菌群變化，為后期預(yù)防絕經(jīng)后女性所引發(fā)的MS提供研究基礎(chǔ)。通過觀察兩組大鼠在種水平腸道菌群的物種組成上的差異，推測這種腸道菌群特征的差異性也是絕經(jīng)前和絕經(jīng)后人群在生理和病理上出現(xiàn)一系列差異的原因之一。

對照組和模型組腸道菌群構(gòu)成在一定程度上存在差異，這種差異是如何進一步導(dǎo)致了疾病的發(fā)生，就需要從功能的角度進一步研究。通過2組大鼠腸道菌群宏基因組的KEGG功能注釋，在level 3層級上，脂多糖生物合成信號通路在模型組中顯著富集。脂多糖生物合成途徑被認為是對抗多重耐藥革蘭氏陰性菌的藥物靶標，lpxA是脂多糖生物合成第一步催化酶的編碼基因，可抑制革蘭氏陰性菌的抗菌活性，可作為新的抗菌靶點[26]。脂多糖是革蘭氏陰性菌細胞壁的特有成分，主要由類脂A、核心多糖和O-抗原組成，它為細菌提供了基本的滲透屏障功能，是賦予細菌抗生素抗性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[27]。脂多糖位于革蘭氏陰性菌表面，負責(zé)維持外膜穩(wěn)定性，這是細胞存活的先決條件[28]。此外，它是抵御有害環(huán)境因素的重要屏障。類脂A合成基因的缺失或抑制會明顯影響細菌的正常生長。lpxK是類脂A生成途徑中的第六種酶，另外，kdsB也參與脂多糖生物合成[28]。脂多糖是全身性低度炎癥的主要原因之一，也被認為是西方飲食、炎癥、肥胖和代謝紊亂之間的關(guān)鍵紐帶[29]。腸道菌群作為人類的一大“能量代謝器官”也參與了MS的形成。由于腸道菌群發(fā)生紊亂，腸黏膜通透性增加，大量脂多糖通過與乳糜微粒結(jié)合或自然滲透入血引起內(nèi)毒素血癥。循環(huán)中脂多糖與脂多糖結(jié)合蛋白結(jié)合后傳遞信號給巨噬細胞表面的CD14分子從而激活Toll樣受體（TLR4），引起免疫應(yīng)答[30]，釋放大量的炎性因子，從而引起機體慢性炎性反應(yīng)。圍絕經(jīng)期引起糖脂代謝紊亂可增加MS的發(fā)病，免疫學(xué)說認為炎癥細胞因子水平可能在PMS發(fā)生發(fā)展中起重要作用[31]。可見，脂多糖生物合成通路中高豐度的lpxA、lpxK、kdsB的表達與PMS相關(guān)。

綜上所述，與對照組大鼠相比，模型組大鼠腸道菌群顯著減少，通過16S rDNA和宏基因測序技術(shù)，將物種水平鑒定到種水平，主要集中在Limosilactobacillus reuteri、Lactobacillus acidophilus和unculturedPrevotellasp.，兩組大鼠腸道菌群的組成發(fā)生變化，可能是導(dǎo)致圍絕經(jīng)期前后出現(xiàn)生理病理學(xué)差異的作用機制。另外通過KEGG功能注釋，模型組脂多糖生物合成信號通路為特征通路，提示與PMS密切相關(guān)。腸道菌群作為一個龐大且復(fù)雜的微生物群體，菌種間有著復(fù)雜的相互影響，在未來探索每個細菌種類具體的生理作用機制的同時，要從腸道菌群整體出發(fā)，將各種微生物的功能聯(lián)系起來，才有可能闡明腸道菌群與絕經(jīng)前后的關(guān)系。該研究為進一步采用敲除lpxA、lpxK和kdsB基因法驗證PMS的研究奠定了基礎(chǔ)。