1個FGG基因新變異致遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的臨床特征和遺傳學分析

王曉歐，王錦院，舒曠怡，游暢，胡榕，王錦樂，林素珍，李姍姍，江明華

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 臨床檢驗中心，浙江 溫州 325027

纖維蛋白原（fibrinogen, Fg）在止血中起核心作用，它是血小板聚集的支持物，纖維蛋白轉化的底物，纖維蛋白溶解和傷口愈合的支架[1]。遺傳性異常纖維蛋白原血癥（congenital dysfibrinogenemia, CD）是編碼Fg的基因（FGA、FGB和FGG）缺陷引起的一種臨床上可表現為自發性出血或血栓形成的罕見遺傳性血液病[2-3]，部分患者有肺動脈高壓等癥狀。有研究[3]顯示，CD患者中42%的人有出血現象，在外傷或合并其他相關凝血系統異常的患者中，出血情況尤為嚴重。因大多數無癥狀的CD患者被漏診或未被報道，該病在人群中發病率尚無具體統計資料[4]。大約一半的CD病例中，偶然發現是最常見的診斷方式[5-7]。筆者對1個CD家系進行了臨床特征和遺傳學分析，現報告如下。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者，男，20歲，因“機器碾壓傷致右手2-4掌骨多發粉碎性開放性骨折伴活動受限3 h”入院進行手術治療，術前凝血檢查發現凝血酶時間（thrombin time, TT）（22.0 s）延長，Fg（0.91 g/L）活性下降。患者既往無自發出血史或血栓傾向史，無肝腎病史及臨床藥物過敏史。家系調查發現先證者母親月經量多、時間長，輕傷后出血難止，其父親和弟弟表現無殊，父母非近親結婚，系譜圖見圖1。本研究通過溫州醫科大學附屬第二醫院倫理委員會審批（批準號LW2018-11），所有家系成員均簽署知情同意書。

圖1 CD家系圖

1.2 方法

1.2.1 常規出凝血指標和生化功能檢測：用枸櫞酸鈉抗凝管采集先證者及家系成員外周血各2.7 mL，供凝血指標及基因檢測用；生化促凝管采集各2 mL，用于血清肝功能及腎功能檢測。法國Stago STA-R全自動血凝儀檢測Fg活性（Clauss法）、TT、部分活化凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time, APTT）、血漿凝血酶原時間（prothrombin time, PT）、纖維蛋白（原）降解產物[fibrin（ogen） degradation products, FDPs]、D二聚體（D-dimer, D-D），采用配套試劑盒進行檢測；德國Siemens ADVIA2400型生化分析儀檢測Fg抗原（試劑盒購自上海太陽生物技術有限公司）和肝、腎功能。

1.2.2 Fg基因檢測：用基因組DNA提取試劑盒（購自美國Axygen公司）對4個家系成員外周血進行基因組DNA的提取；引物由上海生工生物工程有限公司參照文獻[8]進行設計合成，涵蓋Fg 3個編碼基因（FGA、FGB、FGG）所有外顯子及側翼序列，引物序列見表1。用DNA擴增試劑盒（購自大連寶生物工程有限公司）將待檢標本在ECT-811 PCR擴增儀（購自廣州合眾生物科技股份有限公司）進行擴增。PCR產物送杭州擎科生物技術有限公司進行純化、測序，將測序結果通過Mutation Surveyor軟件與參考序列進行比對，發現基因變異位點后再次進行正、反向測序確認并家系驗證。

表1 FGA、FGB和FGG三個基因的引物序列

1.2.3 生物信息學軟件分析：用PolyPhen-2、Mutation Taster和PROVEAN 3個變異位點有害性預測軟件評估變異位點對Fg功能的影響程度，當3種軟件均預測同一遺傳變異對Fg的功能影響較大時，認定該遺傳變異具有高危害性。用PyMol軟件建模分析變異前后Fg的分子三維結構，推測此變異對Fg功能的影響；用同源性分析軟件Clustal X對Fg γ鏈氨基酸序列進行保守性比對；用I-Mutant Suite軟件分析單點變異對Fg穩定性的影響。

1.2.4 血栓彈力圖評估Fg功能：按照血栓彈力圖凝血分析儀（美國血液技術公司, Hemostasis Analyzer TEG 5000）標準操作規程，模擬人體內凝血過程，檢測家系成員相關參數，監測凝血和纖維蛋白溶解整個過程中血凝塊的動態變化，反映全血的凝血和纖溶能力，其中凝塊形成時間（K）和凝固角（Angle）主要反映Fg的功能和水平，綜合凝血指數（CI）反映機體處于低凝或高凝狀態。

2 結果

2.1 臨床表型檢測 在先證者Fg:C 顯著降低（0.91 g/L）而Fg:Ag正常（3.20 g/L），Fg:C/Fg:Ag＜0.7，TT（22.0 s）延長且不能被硫酸魚精蛋白校正；PT、APTT、FDPs、D-D均在正常范圍內，肝腎功能無異常，排除了抗凝系統和繼發因素的影響。其母、弟弟與先證者檢測結果相似，其父各項指標均未見異常，見表2。

表2 家系各成員表型檢測結果

2.2 Fg基因變異分析結果 先證者編碼Fg γ鏈的FGG基因第9外顯子c.1133G＞A雜合變異，導致γ鏈p.Gly378Asp，見圖2A；其母和弟弟攜帶相同變異，父親則為野生型，見圖2B，通過ExAC、千人基因組、gnomAD數據庫檢索，未發現正常人群攜帶該變異，排除此變異為多態性的可能。

圖2 FGG 基因第9號外顯子部分測序圖

2.3 生信軟件預測結果 3款預測軟件均提示FGGc.1133G＞A可能為有害致病的變異，PolyPhen-2評分結果為1.0分（可能有害的）；Mutation Taster預測結果提示c.1133G＞A變異致病，不僅使氨基酸序列發生變化，還有可能改變剪切位點；PROVEAN預測結果為-11.03分（有害的）。

2.4 變異蛋白模型分析FGG基因c.1133G＞A變異，導致p.Gly378Asp，用PyMol軟件建模分析發現，Gly378位于γ鏈D結構域，Gly378的主鏈與Ser404形成一個氫鍵；當Gly378變異為Asp378，側鏈變長，且與Ser404的側鏈增加了一個氫鍵，同時與Thr379增加了兩個氫鍵，見圖3。

圖3 p.γ Gly378Asp變異模型圖

2.5 同源比對保守性分析 用Clustal X軟件對Fg γ鏈氨基酸序列進行同源保守性比對發現，γ鏈第378位氨基酸在不同物種間（人、小鼠、牛、蛙和七鰓鰻）為高度保守性序列，均為甘氨酸，見圖4。

圖4 Fg γ鏈同源序列比對

2.6 變異蛋白質穩定性預測 用I-Mutant Suite軟件分析單點變異對蛋白質穩定性的影響，其DDG值為-0.99 kcal/mol，提示蛋白質穩定性下降（DDG值＞0.5：增加蛋白質穩定性；DDG值＜-0.5：降低蛋白質穩定性；-0.5≤DDG值≤0.5：中性），見圖5A，其提供的PhD-SNP預測結果為致病性變異，見圖5B。

圖5 p.Gly378Asp穩定性預測圖

2.7 血栓彈力圖功能試驗結果 先證者、其母親和弟弟K值均延長，Angle值變小，提示三位c.1133G＞A變異攜帶者Fg功能降低；先證者與其母親CI值變小，提示血液可能處于低凝狀態，先證者弟弟CI值接近正常水平，提示無凝血功能障礙表現；先證者父親K值、Angle值和CI值均在正常范圍內。見表3。

表3 家系各成員血栓彈力圖檢測結果

3 討論

Fg是人體內含量最高的凝血因子，每個Fg分子由一個中央E區和兩個外圍D區組成，D區由Bβ鏈和γ鏈的羧基端構成[9]。γ鏈的D區羧基端有多個功能位點：如D-D的結合位點、形成E-D連接的“a”聚合位點和血小板結合位點等[10]，所以當該羧基端的氨基酸發生改變時，可能影響到這些功能位點而導致Fg功能異常。

本文報道的1例CD家系先證者行右手骨折復位內固定、皮瓣轉移修復術，術中無大出血，術后傷口愈合不良；先證者母親月經量多、時間長，輕傷后出血難止；先證者弟弟無明顯癥狀，三者的臨床表現具異質性，但都符合CD的臨床表現，與文獻[3-4]報道一致。實驗室檢查中，先證者及其母親、弟弟的Fg:C明顯降低而Fg:Ag正常，Fg:C/Fg:Ag＜0.7，TT延長且硫酸魚精蛋白無法將其糾正，符合CD的實驗室診斷標準。

基因分析證實先證者及其母親、弟弟均攜帶FGG基因c.1133G＞A變異，先證者的變異遺傳自其母親，父親為野生型。本例突變p.Gly378Asp，由原來等電點為5.97 的中性氨基酸（Gly）變成了等電點為2.77酸性氨基酸（Asp），所帶電荷及疏水性的改變使這個位點所處的高度保守的D區羧基端結構域發生變化。為了進一步研究p.Gly378Asp對Fg蛋白結構的影響，本研究進行了蛋白模型分析，發現Gly378位于Fg γ鏈D結構域，D結構域含多個功能位點，其中γ400-411附近的氨基酸殘基是血小板膜糖蛋白IIb/IIIa的作用位點，當Gly378變異為Asp378，導致側鏈變長，且與Ser404、Thr379增加了三個氫鍵，改變了空間作用力，影響了血小板膜糖蛋白IIb/IIIa與Fg的結合，阻礙了血小板的聚集，使凝塊形成變慢。本研究還應用I-Mutant Suite軟件分析p.Gly378Asp變異對蛋白質穩定性的改變，其DDG值為-0.99 kcal/mol，再次證實蛋白質穩定性存在下降。

血栓彈力圖的三個參數K值、Angle值和CI值可以作為CD診斷的參考指標，K值和Angle值具有較高的特異性和敏感性，可以評估CD患者的整體止凝血狀態，甚至預測出血或血栓形成的風險。本研究利用血栓彈力圖試驗發現，先證者及其母親、弟弟的血凝塊聚合的速率減低，提示三位家系成員Fg功能低下，先證者及其母親CI值降低，提示兩者處于低凝狀態，可能有出血風險，需長期監測，避免出血風險；先證者弟弟CI值接近正常水平，提示無凝血功能障礙表現，這與其弟弟無癥狀的臨床表型一致。通過血栓彈力圖試驗，驗證了c.1133G＞A導致Fg多功能位點的D結構域改變而使其功能下降的分子發病機制。

根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（The American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）制定的臨床變異解讀標準和指南，對FGG基因c.1133G＞A變異的致病性進行分析，檢索千人基因組、gnomAD、ExAC數據庫未見正常人攜帶該變異（PM2）；變異在家系中共分離（PP1）；經HGMD專業版數據庫查詢，FGG基因c.1133G＞A變異（p.Gly378Asp）未見報道，γ鏈的Gly378在不同物種間同源序列比對具有高度的保守性（PP2），見圖4；3個生信軟件預測c.1133G＞A變異均為有害的（PP3）；先證者及家系成員的表型符合CD臨床表型（PP4）。支持證據組合為：PM2+PP1+PP2+PP3+PP4，根據ACMG指南，判定c.1133G＞A（p.Gly378Asp）變異為可能致病性變異。

此外，在先證者及其父親和弟弟FGB基因第8號外顯子存在c.1433G＞A（p.Arg478Lys）雜合改變，BβArg478Lys是一個常見的多態性，位于Bβ分子的C-端，在分子水平上具有顯著的表型效應。研究表明，它與冠狀動脈疾病的嚴重程度有關，也與腦卒中的發育狀況有關，攜帶這個多態性位點將可能增加血栓風險事件。

國外一項研究[11]表明，在CD診斷后平均隨訪8.8年中，CD患者有大出血（包括產后出血）的高風險，還有血栓事件的高風險。與血栓相關的Fg變異的患者尤其危險，在這種患者中，應考慮長期抗凝[12]。在某些特定的臨床環境下，抗纖溶藥物也是CD治療的一部分[12]。

本研究報道了一例FGG基因新變異（c.1133G＞A）致CD家系，拓寬了FGG基因突變譜；同時還發現該家系中3位成員存在BβArg478Lys多態性改變，故應長期觀察先證者及其家系成員在不同狀態下Fg功能的動態變化，有助于指導CD患者的治療，也有助于為進一步闡明基因型和臨床表現的關系提供依據。