運動抑制3-羥甲基戊二酰-CoA合成酶2表達減輕阿霉素所致小鼠心肌病的作用

陳海麗，沈康敏，陳躍偉，王莉，陸俊宏，李盛村，屠文展

1.溫州醫科大學附屬第二醫院 康復醫學中心，浙江 溫州 325027；2.浙江省針灸康復重點實驗室溫州市康復重點實驗室，浙江 溫州 325027

阿霉素是最常見的化療藥之一，但其心臟毒性限制了阿霉素在癌癥化療中的應用。研究表明，沒有原發性心肌病時阿霉素可誘導急性心肌病模型，模型小鼠表現為體質量減輕，心臟重量減小，心肌損傷標志物增加[1]。阿霉素也可誘導慢性心臟毒性動物模型，模型小鼠心臟出現炎癥、氧化應激和心肌細胞凋亡[2]。此外，阿霉素可引起小鼠心臟內皮細胞破壞，內皮損傷標志物增加[3]。

合理運動是心臟康復的重要手段，也有提高免疫力和清除癌癥細胞的能力。耐力運動（尤其是高強度重復次數）可以促進骨骼肌、心肌生理性適應，心肌和骨骼肌增厚，這種運動“預處理”方式，可以抵抗阿霉素造成的肌肉萎縮表型[4]。除了耐力運動，抗阻運動（每組10次，每次3組，每周3次，持續8周）也可以改善阿霉素所致慢性心肌病舒張動脈壓、心率、交感神經張力和氧化應激[5]。此外，低中強度的有氧運動減輕了阿霉素引起的心肌萎縮，恢復了心肌細胞橫截面積[6]。然而，運動改善阿霉素心肌病的分子機制仍不完全清楚。

盡管3- 羥甲基戊二酰-C o A 合成酶2（3-hydroxymethyl glutaryl-CoA synthase 2,HMGCS2）是酮體合成的限速酶[7]，且補充酮體可能對心衰患者有益[8]。但在其他心肌病研究中發現，運動抑制HMGCS2能改善脂毒性心肌病[9]；類似的，在非酒精性脂肪肝中，抑制HMGCS2也能夠減少肝纖維化和肝臟脂肪沉積等病理改變[10]。截至目前，仍鮮有研究揭示HMGCS2在阿霉素引起的心肌病中的作用。本研究探討運動調控HMGCS2在預防阿霉素所致的心功能降低過程中的作用，以期為尋找治療阿霉素心肌病的新靶點提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：6～8周齡雄性C57BL/6小鼠購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司[動物許可證號：SCXK（浙）2019-0001]，飼養于溫州醫科大學實驗動物中心SPF級動物實驗室。飼養標準條件：恒溫20～22 ℃，每天接受12 h光照。小鼠自由進食飲水。

1.1.2 試劑與儀器：阿霉素購自北京索萊寶生物試劑有限公司。Vevo2100小動物超聲成像儀購自加拿大Visualsonics公司。TRIzol、反轉錄試劑盒及定量PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。HMGCS2一抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及干預造模：小鼠隨機分為靜養對照組（Con組）、阿霉素組（Dox組）、運動+阿霉素組（Exe組），每組6只。Con組靜養，Dox組采用腹腔注射20 mg/kg阿霉素，Exe組在腹腔注射阿霉素之前進行30 d游泳運動。Exe組運動安排如下：在方形塑料框（60 cm×50 cm×40 cm）中裝30 ℃溫水，將小鼠置于塑料框中開展游泳運動。第1 周進行適應性訓練，水位高度7 cm，從第2周開始游泳時間從10 min逐漸增加至40 min，水位高度15 cm，迫使小鼠保持40 min游泳，正式游泳時間30 d。30 d游泳結束4 h后，注射阿霉素制造心肌損傷模型。

1.2.2 小鼠心臟功能評價及心臟組織取材：阿霉素注射后第4天，將其用異氟烷麻醉并脫毛，超聲探頭獲取心尖四腔位，M模式下獲取心臟超聲影像，并計算心臟射血分數（ejection fraction, EF），短軸縮短率（fractional shortening, FS），和E/A比值。阿霉素注射后第5 天，采用水合氯醛麻醉后，打開小鼠胸腔，剪取心臟，迅速擠壓出心腔內血液，并剪去心底部血管，冷凍。

1.2.3 心肌細胞橫截面積評估：組織用4%多聚甲醛固定，自動脫水機脫水，包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，用WGA熒光染料染色1 h，含DAPI的防熒光猝滅封片劑封片。在奧林巴斯熒光顯微鏡下，攝取圖片，用ImageJ軟件進行數據統計。

1.2.4 心臟組織mRNA表達檢測：用TRIzol等提取和分離總RNA，分光光度計測定RNA濃度，評定RNA純度，利用試劑盒進行反轉錄，最后對樣本cDNA進行PCR定量。使用的引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.2.5 心臟組織蛋白表達檢測：用適量裂解液、磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑等裂解組織，剪刀剪碎組織后勻漿，BCA法測定蛋白濃度，配好蛋白體系后，利用SDS-PAGE凝膠電泳法使蛋白分離，再用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，封閉，總caspase-3（T-caspase-3，1:1 000，美國Proteintech公司），激活的caspase-3（C-caspase-3，1:1 000，美國Proteintech公司），HMGCS2（1:1 000，美國Santa Cruz公司）和GAPDH（1:5 000，美國Proteintech公司）一抗過夜，二抗孵育等步驟后，在化學發光凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）中利用超敏ECL化學發光液（蘇州新賽美生物科技有限公司）使蛋白顯影。

1.2.6 HL-1細胞培養及HMGCS2抑制：HL-1細胞由上海冠導生物工程有限公司提供，使用DMEM完全培養基（含10% FBS、100 U/mL青霉素和10 U/mL鏈霉素）進行細胞培養（37 ℃，5% CO2）。細胞貼壁至80%左右，用0.02%姨酶消化細胞，接種于24孔板，進行細胞正式實驗。在培養的細胞中加入50 nmol/L HMGCS2 siRNA（上海吉瑪制藥技術有限公司），處理24 h后，加入阿霉素（2 μmol/L），干預16 h，并進行細胞活力和細胞凋亡相關指標測試。

1.2.7 CCK8檢測細胞活力：細胞活力按照上海碧云天公司的CCK8試劑盒說明書檢測，試劑加入15 min后，以450 nm波長檢測吸光度值。

1.3 統計學處理方法 使用GraphPad Prism v5.0軟件統計分析。計量資料采用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 運動預防阿霉素所致小鼠心臟功能紊亂 與Con組比，Dox組小鼠心臟功能降低（P＜0.05）。與Dox組小鼠相比，運動可減輕阿霉素引起的心臟收縮和舒張功能的損害（P＜0.05）。見圖1。

圖1 運動對阿霉素心肌病小鼠心臟功能的影響

2.2 運動改善阿霉素所致小鼠心肌萎縮 與Con組比，Dox組小鼠平均心肌細胞橫截面積明顯減少（P＜0.05），2 個萎縮的基因標志物Atrogin-1 及MuRF-1的mRNA相對表達量明顯升高（P＜0.05）。與Dox組小鼠相比，運動干預可顯著改善阿霉素導致的上述心肌萎縮指標（P＜0.05）。見圖2。

圖2 運動改善阿霉素心肌病小鼠心肌萎縮

2.3 運動減少阿霉素誘導心肌病中HMGCS2的表達與Con組比，Dox組小鼠心臟中HMGCS2 mRNA和蛋白表達量均顯著升高（P＜0.05）。與Dox組小鼠相比，Exe組HMGCS2 mRNA和蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 運動對阿霉素心肌病小鼠心臟HMGCS2 mRNA和蛋白表達的影響

2.4 抑制HMGCS2增加阿霉素處理的心肌細胞生存細胞實驗結果表明，阿霉素引起HL-1心肌細胞細胞活力降低（P＜0.05），細胞中HMGCS2表達增加、C-caspase-3/T-caspase-3比值增加（P＜0.05），而采用siRNA抑制HMGCS2表達后，可以提高心肌細胞活力（P＜0.05），C-caspase-3/T-caspase-3比值降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 抑制HMGCS2對阿霉素引起的心肌細胞活力和凋亡的的影響

3 討論

近年來，由于各類創新方法的研究，阿霉素的應用得到進一步維持和拓展。ZHOU等[11]發現將阿霉素結合CD133（肝癌干細胞樣細胞標志物）形成適體，靶向治療肝癌細胞，可以減少對其他細胞的傷害。負載阿霉素的膠束低分子量肝素-蝦青素納米顆粒，通過抑制中性粒細胞胞外陷阱（neutrophicle extracellular traps, NETs）的形成，能夠關閉炎癥前饋環和網狀結構的形成，抑制肝轉移，抑制肺轉移，緩解腫瘤的炎癥和免疫抑制微環境，為乳腺癌及其肝、肺轉移提供了一種有希望的治療策略[12]。此外，功能納米顆粒還可以負載阿霉素與IL-2和干擾素-γ，利用增強免疫應答的方法，促進阿霉素抗腫瘤作用[13]。同樣，阿霉素聯合miR-34a[14]和STAT3 siRNA[15]均能增強阿霉素的抗腫瘤效益。因此，阿霉素的應用得到進一步延續和拓展，其對機體的不良反應機制仍值得進一步研究。

長期使用阿霉素抗腫瘤導致心臟、腎臟等不良反應，是限制阿霉素的主要因素。研究證實，即使沒有原發性心臟病，阿霉素作為化療藥物使用也會導致心功能不全[16]。在阿霉素急性小鼠模型中，降低炎癥應答（例如IL-22敲除）有助于緩解心臟毒性，降低了血清和左心室組織中心肌損傷標志物的表達，并改善心功能[17]。此外，減少氧化應激也能降低阿霉素引起的心肌損傷[18]，例如小鼠NADPH氧化酶2缺陷，減少了超氧化物產生，可以消除阿霉素相關急性心臟損傷[19]。

除了傳統生理機制研究外，在動物實驗中，基因干預手段也被用于阿霉素相關心肌病研究領域。采用腺相關病毒實現心臟特異的miR-204過表達，可以抵抗注射阿霉素（15 mg/kg）導致的心肌損傷[18]。同樣，過表達miR-146a通過靶向TAF9b/P53途徑減少阿霉素引起的心肌凋亡，部分逆轉了阿霉素誘導的心臟毒性[20]。本研究結果與上述結果一致，中高劑量的阿霉素引起急性心臟功能降低。

藥理學方法和基因療法在臨床轉化方面，仍需要較長時間的安全性檢驗。運動作為無創而安全的非藥理學治療方式，可以增強免疫功能，又能夠直接減緩各類心肌病的發生和發展[21-22]。本研究結果表明，運動干預減少了阿霉素所致心肌萎縮的發生，可能是改善心臟功能的重要機制。本研究結果提示，阿霉素化療之前，給予一定的運動康復方案，可能有助于減輕阿霉素引起的心血管不良事件，也可能更有利于癌癥患者整體康復。

然而，短期的運動并不能達到這些良好的護心效益，并且部分患者無法運動和不愿意運動。因此，研究運動保護阿霉素心肌病的機制尤為重要。運動產生的活性物質，可以模擬運動效益，為阿霉素相關的心肌病藥物研發提供實驗支持。在機制上，本研究還初步確定了運動可能通過抑制HMGCS2而發揮阻止阿霉素心肌病的作用。在本課題組之前的研究中也發現，HMGCS2在脂毒性心肌病小鼠心臟中表達增加，抑制HMGCS2后可以減少高濃度棕櫚酸引起的心肌細胞凋亡[9]。類似的，在非酒精性脂肪肝小鼠肝臟中，運動也可以減少HMGCS2的表達[10]，在肝細胞中抑制HMGCS2也能夠降低棕櫚酸引起的細胞凋亡[23]。在阿霉素引起的心肌萎縮和心功能降低過程中HMGCS2的作用仍未見報道。本研究結果表明，在阿霉素所致心肌萎縮過程中，增加的HMGCS2可能促進β羥基丁酸等酮體中介產物形成，進一步損害阿霉素心肌組織中心肌細胞代謝[24]。運動通過減少HMGCS2的表達而減少心肌細胞凋亡，最終有利于心臟功能保存。然而，HMGCS2保護阿霉素引起的心肌萎縮的分子作用仍需進一步實驗研究。

總之，在阿霉素所致心肌病小鼠中，運動通過抑制HMGCS2減少心肌細胞凋亡，從而改善心肌萎縮和心臟功能。