基于Keap1/Nrf2信號通路研究電針對神經病理性疼痛大鼠線粒體自噬的影響

程博，屠文展，樓新法，楊觀虎，蔣松鶴，3，吳巧云，3

1.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 康復醫學中心，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學中美針灸康復研究所 整合優化醫學研究中心，浙江 溫州 325035；3.溫州市康復重點實驗室 浙江省針灸康復重點實驗室，浙江 溫州 325027

神經病理性疼痛現今還難以完全治愈[1]。目前對神經性疼痛的治療包括藥物療法、神經調節療法及手術治療等[2]。盡管有多種治療選擇，由于其病因的復雜性，目前治療效果并不十分滿意。電針因其不良反應小，在神經病理性疼痛治療方面得到廣泛應用[3]，但其作用機制還有待進一步研究。線粒體自噬在保護受損細胞方面起著重要的作用[4]。線粒體自噬的誘導可緩解周圍神經損傷引起的神經病理性疼痛[5]。同時有研究表明，Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1, Keap1）/核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid-related factor 2, Nrf2）信號通路的激活可促進線粒體自噬并緩解神經病理性疼痛[6-7]，但電針是否通過調控線粒體自噬改善神經病理性疼痛尚不明確。本研究通過檢測電針對L5脊神經結扎（spinal nerve ligation, SNL）大鼠疼痛閾值、脊髓背角線粒體形態結構及自噬相關蛋白表達量的影響，研究電針治療神經性疼痛疾病的部分機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量200～250 g，購于溫州醫科大學實驗動物中心［SYXK（浙）2020-0014］。大鼠飼養于22～24 ℃、50%～70%相對濕度、晝夜交替規律變化的房間中，自由飲水及飲食。39只大鼠通過抽簽隨機平均分為3組：假模組、模型組及電針組。

1.2 SNL模型制作 對模型組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉使大鼠麻醉，后背部去毛備皮，以L5棘突為中心縱向切開皮膚及肌肉組織約1 cm，暴露右側L5橫突。將L5橫突去除后對右側L5脊神經進行結扎。對造模大鼠進行單籠飼養，正常飲水及飲食。對假模組大鼠進行相同操作但不進行神經結扎。

1.3 干預方法 將大鼠固定于本實驗室設計的專用大鼠固定器（專利申請號：201110021482.5，國家知識產權局）上，采用韓氏電針儀對大鼠右側“足三里”及“昆侖”穴進行電刺激，針刺深度為2～3 mm，頻率2/100 Hz，強度1.5 mA，時間30 min，從術后第8天開始每天治療1次，連續治療7 d。

1.4 檢測方法

1.4.1 熱閾檢測：于造模前（0）及造模后第3、5、7、10、12、14 天（同一時間段：14:00—17:00）對大鼠進行熱閾檢測。檢測儀器為37370型爪熱覺測試儀（意大利UGO公司）。大鼠于儀器內安靜狀態下適應30 min，紅外光對準右側足底中心，足部因熱感出現疼痛反應時引起足部上抬，儀器熱源自動切斷，記錄此時熱閾值。檢測方法每隔5 min進行1次，連續進行5次，結果為去掉最大和最小值后的平均值。

1.4.2 機械痛閾檢測：于造模前（0）及造模后第3、5、7、10、12、14天（同一時間段：14:00—17:00）對大鼠進行痛閾檢測。檢測儀器為2450型爪痛覺測試儀（美國IITC LifeScience公司）。大鼠于儀器內安靜狀態下適應30 min，探針頭部對準大鼠患側足底中心并緩慢加壓，當大鼠足部出現逃避性反應偏離探針頭部時，記錄此時痛閾數值。檢測方法每隔5 min進行1次，連續進行5次，結果為去掉最大和最小值后的平均值。

1.4.3 HE染色：電針治療后第7天對各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）使其深度麻醉。用0.9%氯化鈉溶液經主動脈對大鼠進行灌注，直至大鼠肝肺變白，后轉為4%多聚甲醛對大鼠進行灌注使其身體僵硬。取大鼠L4-6脊髓節段于4%多聚甲醛中固定24 h。取出組織置于不同濃度乙醇中進行梯度脫水，之后將組織用石蠟進行包埋，冠狀切面切下系列切片。每連續4張切片取一張行HE染色。切片先用蘇木素對其進行染色，之后經伊紅染液染色，之后配置不同濃度的乙醇進行梯度脫水，從二甲苯中取出后進行封片處理，最后在顯微鏡下觀察組織結構。

1.4.4 透射電鏡觀察：術后第14天腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）對大鼠進行深度麻醉，取L4-6脊髓節段（約1 cm），沿脊髓背角縱向將標本切成1 mm×1 mm×2 mm的長條若干，迅速放入戊二醛內保存于4 ℃冰箱進行固定。經PBS漂洗后于1%鋨酸內震蕩處理5 min，后將組織浸于1%醋酸鈾內震蕩5 min，梯度脫水后將組織進行包埋。經半薄切片觀察組織的固定效果后進行超薄切片，線粒體結構通過透射電鏡進行觀察，并拍攝采集圖片。

1.4.5 蛋白質印跡（Western blot）法檢測：術后第14天腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）對大鼠進行深度麻醉，取L4-6脊髓節段（約1 cm），將脊髓置于蛋白裂解液中進行勻漿，充分裂解后取上清進行BCA蛋白濃度檢測。對蛋白進行電泳，后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，之后將條帶放入一抗中4 ℃孵育16 h：兔源性Keap1一抗（1:1 000；美國Affinity公司）；兔源性Nrf2 一抗（1:1 000；美國Affinity公司）；兔源性BCL2和腺病毒E1B19 kDa相互作用蛋白3類似體（NIX）一抗（1:1 000；美國Affinity公司）；兔源性BCL2和腺病毒E1B19 kDa相互作用蛋白3（BNIP3）一抗（1:1 000；美國Affinity公司）；兔源性GAPDH一抗（1:5 000；美國Bioworld公司）。之后將條帶轉入山羊抗兔IgG二抗（1:5 000；上海碧云天生物技術有限公司）中1 h。化學發光儀曝光后，AlphaEaseFC 4.0軟件分析獲取條帶灰度值。

1.5 統計學處理方法 采用SPSS23.0軟件進行統計分析。正態分布計量資料以±s表示，疼痛閾值檢測采用雙因素方差分析，Bonferroni's進行事后檢驗。其余多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者予Tukey進行組間兩兩比較，方差不齊者予Dunnett'sT3進行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學觀察

2.1.1 大鼠患側熱縮足反射潛伏期：與假模組相比，模型組大鼠在造模后患側后肢的熱閾明顯降低（P＜0.01），并在后期保持在較低水平；電針治療組大鼠患側后肢熱閾逐漸升高，與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 熱縮足反射潛伏期結果

2.1.2 大鼠患側機械縮足反應閾值：與假模組相比，模型組大鼠在造模后患側后肢的機械痛閾明顯降低（P＜0.01），并在后期保持在較低水平；電針治療組大鼠患側后肢機械痛閾逐漸升高，與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 機械縮足反應閾值

2.2 HE染色 假模組大鼠脊髓背角神經元形態結構正常，組織致密。模型組大鼠脊髓背角神經元核固縮明顯，細胞變性，組織疏松。電針治療后，大鼠脊髓背角神經元形態結構改善，核固縮減少。見圖3。

圖3 HE染色結果

2.3 透射電鏡觀察 假模組可見正常形態的線粒體，細胞內未見自噬體及溶酶體；模型組脊髓背角線粒體數目增多，腫脹變形，可見自噬溶酶體結構，細胞出現壞死及凋亡；與模型組相比，電針治療組大鼠脊髓背角細胞結構較完整，腫脹減輕，細胞內可見明顯的自噬溶酶體結構，細胞壞死及凋亡現象減少。見圖4。

圖4 透射電鏡結果

2.4 Western blot檢測 與假模組相比，模型組大鼠Keap1、Nrf2、NIX、BNIP3蛋白表達升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；電針治療后Keap1蛋白表達降低，Nrf2、NIX、BNIP3蛋白表達升高，差異均有統計意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠Keap1、Nrf2、NIX、BNIP3蛋白表達結果

3 討論

神經病理性疼痛以痛覺超敏、痛覺過敏及自發性疼痛等為特征，臨床上治療效果有限，嚴重影響患者的生活質量。線粒體自噬是一種選擇性自噬，能夠在一定程度上清除受損的線粒體，在細胞形態及功能維持方面起著重要作用[8]。同時有研究表明，線粒體自噬與神經病理性疼痛密切相關[7]。目前研究線粒體自噬的方法主要為透射電鏡下觀察線粒體的形態結構的變化情況及細胞自噬溶酶體的形成情況。同時NIX、BNIP3都是線粒體膜蛋白，NIX及BNIP3 的表達量變化可以反映線粒體自噬的情況[9-11]。本研究結果發現，SNL造模后，大鼠隨即出現患側疼痛癥狀，脊髓背角線粒體數目增多，周圍出現自噬溶酶體結構，細胞破壞嚴重，伴隨著NIX、BNIP3蛋白表達量的升高。以上結果表明線粒體自噬在神經病理性疼痛中發揮重要的調節作用。

Nrf2 是堿性亮氨酸拉鏈家族轉錄因子的一份子，正常情況下，胞漿中的Nrf2與Keap1結合，受Keap1泛素化修飾，進而被蛋白酶體系統降解[12]。在細胞受刺激時，ROS可對Keap的半胱氨酸殘基進行修飾，從而使Nrf2進入細胞核，與轉錄因子組成異二聚體，從而與抗氧化還原反應元件結合，啟動下游靶基因轉錄[13]。Keap1的自噬降解可激活抗氧化轉錄因子Nrf2并保護細胞免受ROS的侵害[14]。同時有研究表明Keap1/Nrf2與疼痛密切相關。LIU等[15]發現在坐骨神經慢性壓迫損傷模型中，Keap1 過表達伴隨著Nrf2 水平上升以及疼痛閾值的降低，Keap1基因沉默減輕了CCI大鼠的神經性疼痛。LAN等[16]研究表明Nrf2 基因敲除阻斷了Keap1/Nrf2/HO-1信號傳導，并部分減弱了右美托咪定的鎮痛和抗炎作用。本研究通過Western blot觀察到SNL大鼠損傷14 d后，脊髓背角Keap1、Nrf2表達升高，表明Keap1、Nrf2可能參與了周圍神經損傷引起的疼痛反應。

電針已在臨床上被廣泛應用于治療各種慢性疼痛性疾病。針灸（包括普通針刺、電針等）具有多途徑傳導的反饋調節作用（多元針灸反饋規律）[17]。不同穴位不同強度電針刺激所產生的效果可能不同。本研究選取的“足三里”和“昆侖”穴為治療下肢疼痛的常用有效穴[18-19]。“足三里”和“昆侖”穴分別屬于足陽明胃經及太陽膀胱經，有強筋骨、調氣血、舒筋活絡、鎮痛等功效。同時作為坐骨神經分支的腓深神經及腓腸神經分別從“足三里”和“昆侖”穴深層經過，電針可對其產生刺激，同時作用于鄰近血管，將刺激信號上傳到脊髓直至大腦，調節機體的疼痛反應[20]。有研究表明，電針可通過調節miR-206-3p/BDNF通路發揮抗炎和抗凋亡作用，從而緩解神經性疼痛[21]。ZHAO等[22]研究表明電針治療可通過抑制脊髓膠質細胞和TLR4/NF-κB通路減輕紫杉醇誘導的大鼠神經性疼痛。然而，脊髓背角線粒體自噬變化與電針鎮痛效果的關系尚未得到充分的驗證。本研究結果表明，電針提高了SNL大鼠的疼痛閾值，脊髓背角神經元結構明顯改善，線粒體腫脹減輕，周圍可見自噬溶酶體結構，無明顯壞死或凋亡現象。同時電針治療抑制了SNL大鼠Keap1的蛋白表達量，促進了Nrf2、NIX、BNIP3蛋白表達量。這些結果提示電針的鎮痛作用可能部分是通過Keap1/Nrf2信號通路促進線粒體自噬達到的。

綜上所述，電針的鎮痛作用可能與Keap1/Nrf2信號通路參與的線粒體自噬有關。但其具體機制有待于后續應用Keap1/Nrf2抑制劑或基因敲除技術進行進一步研究。