大櫻桃矮化砧木吉塞拉6號的組織培養和快速繁殖技術研究

畢海林，木永青，郭 淼，和加衛，王朝文，和志嬌，楊燕林，楊正松*

（1.云南省農業科學院 高山經濟植物研究所，云南 麗江 674199；2.麗江藍瑪生物科技開發有限責任公司，云南 麗江 674100）

大櫻桃矮化砧木吉塞拉6號(Gisela 6)由德國育成，是酸櫻桃(Prunus cerasus L)與灰毛葉櫻桃(Prunus canescens)進行種間雜交培育的三倍體雜種，其植物學性狀特點類似于灰毛葉櫻桃，在歐洲、北美地區被廣泛種植，并于1998年經美國引入我國，于2004年12月通過國家林業和草原局林木良種審定。塞拉6號與大多數大櫻桃品種的親合性良好，具有明顯的矮化、豐產、早實性強、抗病、耐澇、土壤適應范圍廣、固地性能好、抗寒、產量高等優點。栽植嫁接苗3年可見果，5年可達豐產。吉塞拉6號與大櫻桃品種的適配性好，很少出現排斥現象，這也是吉塞拉6號能夠迅速在我國推廣應用的原因［1-2］。吉塞拉6號為無性系砧木，不能采用種子繁殖；扦插繁殖需要大量的枝條且速度較慢，不能在短期內獲得大量砧木苗。本文對大櫻桃矮化砧木吉塞拉6號進行了組織培養研究，摸索出了吉塞拉6號的組織培養及其快速繁殖技術，為大櫻桃矮化砧木吉塞拉6號的工廠化育苗以及大櫻桃的產業發展奠定了物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

吉塞拉6號枝條取自云南省農業科學院高山經濟植物研究所麗江美自科研基地。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒與初代培養 以吉塞拉6號帶腋芽莖段作為外植體。4月初對吉塞拉6號的嫩枝條進行處理，剪成帶1個腋芽的莖段。外植體消毒和接種按以下方式進行：將莖段用洗衣粉液浸泡10 min，流水沖洗2 h，然后放入超凈臺，70%乙醇消毒30 s，無菌水浸洗3次；再用0.1%升汞溶液消毒6 min，無菌水浸洗5次后供接種使用，莖段接種到誘導培養基上。8種誘導培養基：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA上，培養溫度為(25±2)℃，光照強度3000 lx，光照時間12 h/d，培養基pH值5.8，蔗糖30 g/L。每瓶培養基接種1個莖段，以50個莖段為1個組合，分別重復3次，接種后觀察并記錄莖段的生長變化情況，45 d后對莖段的生長情況進行統計分析。

1.2.2 繼代增殖培養 培養基均為MS培養基。將初代培養腋芽萌發的新枝剪成約1 cm的莖段，接種到含不同激素配比的增殖培養基上。8種增殖培養 基：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，培養條件與初代培養相同，每瓶接4個莖段，45 d后測量苗的高度、叢生芽數，以及統計新轉接的培養瓶數，每種配方統計測量3瓶。

1.2.3 試管內生根培養與煉苗移栽 將試管苗剪去基部愈傷組織，并剪成約3 cm的莖段，接種到生根培養基中。4種生根培養基：1/2 MS+0.5 mg/L IBA+2.0 g/L AC、1/2 MS+1.0 mg/L IBA+2.0 g/L AC、1/2 MS+1.5 mg/L IBA+2.0 g/L AC、1/2 MS+2.0 mg/L IBA+2.0 g/L AC，其中，AC為活性炭，每瓶接種20苗，培養條件與初代培養及繼代培養相同，蔗糖為15 g/L。第45天觀察統計其生根的情況，每種配方統計測量3瓶。

煉苗移栽按采用以下4種方式：(1)生根培養第3天進行試管苗煉苗，第10天進行移栽；(2)生根培養第13天進行試管苗煉苗，第20天進行移栽；(3)生根培養第23天進行試管苗煉苗，第30天進行移栽；(4)生根培養第33天進行試管苗煉苗，第40天進行移栽。

試管苗煉苗即將培養瓶微開蓋，3 d后將瓶蓋打開1/3左右，再過2 d將瓶蓋去除，2 d之后進行洗苗并移栽至苗床。以草炭土+珍珠巖(10∶1)作為苗床基質，移栽前用消毒劑將苗床進行消毒，移栽時剪去部分葉片，移栽后要注意保持空氣相對濕度，并遮陰養護。30 d后統計試管苗的移栽成活率，并測量苗的生長量。

1.2.4 試管外生根 將試管苗剪去基部愈傷組織，并剪成約2 cm的莖段，蘸1000 mg/L IBA后分別扦插在粉碎苔蘚、草炭土+珍珠巖(20∶1)、椰糠+珍珠巖(20∶1)、松針粉+珍珠巖(20∶1)等4種基質中，基質分別盛放在70孔穴盤中，每種基質觀察3盤，扦插后放入大棚的塑料小拱棚內，觀察生根情況，并在第45天統計生根情況；第75~90天將穴盤苗上營養缽或進行大田移栽。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對吉塞拉6號初代培養的影響

由表1可以看出，吉塞拉6號帶腋芽的莖段在初代培養基中腋芽很快就開始萌發，多數在培養的第5天就開始萌發（圖1A）。8種培養基中腋芽的萌發率均在78.0%以上，在添加NAA的培養基中腋芽的萌發率比添加IBA的培養基中腋芽的萌發率略高，基本在80%以上，并且添加NAA的培養基中腋芽萌發后伸長較多。第45天時進行統計測量，伸長的腋芽枝條長度普遍在3 cm以上。另外，對比4種激素濃度發現，較高濃度的生長素NAA和IBA更有利于吉塞拉6號腋芽枝條的萌發和生長，并且NAA比IBA的促進效果更顯著。因此，選擇MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA可作為吉塞拉6號較佳的初代培養莖段腋芽的啟動培養基。

圖1 吉塞拉6號在各培養階段的生長情況

表1 不同激素配比對吉塞拉6號外植體萌發及生長的影響

2.2 不同激素配比對吉塞拉6號不定芽分化和增殖的影響

由表2可以看出，在不同濃度6-BA和NAA的繼代培養基中，吉塞拉6號均能較好地增殖，苗的基部均形成少量淡綠色愈傷組織，并分化形成較多的叢生芽（圖1B）。在6-BA濃度為1.0 mg/L時，隨著NAA濃度的升高，產生叢生芽數也明顯隨之增多；在6-BA濃度為2.0 mg/L時，隨著NAA濃度的升高，產生的叢生芽數也明顯增多。但是比較2種6-BA濃度發現，在NAA濃度相同時，6-BA濃度為2.0 mg/L的平均叢生芽數反而比6-BA濃度為1.0 mg/L時略少。不同濃度6-BA和NAA的培養基中苗高的差異不明顯。1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA組合的增殖系數最高，為11.03。故MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為吉塞拉6號較佳的增殖培養基。

表2 不同激素配比對吉塞拉6號不定芽分化和增殖的影響

2.3 生根培養與煉苗移栽

2.3.1 不同濃度IBA對吉塞拉6號生根的影響 由表3可以看出，在4種生根培養基中，當苗接種到生根培養基中之后，苗基部逐漸形成淡綠色、緊致的愈傷組織，約6 d后可以看到愈傷組織上出現根原基分化的跡象，隨后逐漸伸長成白色根（圖1C），再逐漸發育成粗壯的淡黃色被絨毛的肉質根。隨著培養基中生長素IBA濃度的升高，苗基部愈傷組織也稍微隨之增大，生根數略微降低，但是根長卻隨IBA濃度的升高而伸長，生根率隨IBA濃度的升高而表現出略微降低的趨勢。綜合來看，1/2 MS+0.5 mg/L IBA+2.0 g/L AC是吉塞拉6號較佳的生根培養基。

表3 不同濃度IBA對吉塞拉6號生根的影響

2.3.2 不同誘導生根時間對吉塞拉6號生根與成活率的影響 由表4可以看出，吉塞拉6號試管苗在生根培養基中誘導生根第10天移栽時，根還很短，根數也很少，多為表面光滑的白色肉質根，移栽時不用剪根，但生根率較低，僅為63.6%，移栽后的成活率也較低，這可能是根發育尚不成熟，在一定程度上影響了苗的正常生長。吉塞拉6號試管苗誘導生根第20天進行移栽時，根還較短，平均根長為1.14 cm，但根數較多，是表面光滑的淡黃色肉質根，生根率較高，達到87.5%，并且移栽后的成活率也較高，達到90.4%，說明此時根已經發育較成熟，且由于移栽時不需要剪根，對根的損傷較小，所以苗在移栽后的成活率高。隨著吉塞拉6號試管苗在生根培養基中誘導生根時間的延長，根越來越長，平均根數變化不明顯，生根率增長也不明顯，根逐漸發育成表面被絨毛的淡黃色粗但松軟的肉質根，移栽時必須剪去底部一大段根，這將導致根系在一定程度上受到損傷，移栽后苗的成活率也略微降低。綜上所述，吉塞拉6號生根培養第13天時進行試管苗煉苗，第20天時移栽，移栽后的成活率較高，為最佳的生根誘導和移栽時間。

表4 不同誘導生根時間對吉塞拉6號生根與成活率的影響

2.4 不同基質對吉塞拉6號培養瓶外生根的影響

由表5可以看出，在4種基質中，吉塞拉6號枝段基部均在第8天逐漸產生少量愈傷組織，第12或13天以后愈傷組織及其稍上方逐漸長出白色短根。吉塞拉6號在4種基質中的生根率差異不明顯，均達到88%以上，其中以粉碎苔蘚基質的生根率最高，為90.6%；在4種基質中苗生根一段時間后，均開始逐漸長高，其中粉碎苔蘚、草炭土+珍珠巖2種基質中的苗生根后長高較多，但兩者差異不大。綜合來看，粉碎苔蘚是吉塞拉6號較好的瓶外生根基質。

表5 不同基質對吉塞拉6號培養瓶外生根的影響

3 討論與結論

在云南用于大櫻桃生產的砧木中，吉塞拉6號砧木應用最多，占總面積的60%；西南櫻桃、細齒櫻桃次之，占總面積的30%；其余砧木應用則相對較少，僅占總面積的10%［3］。目前，有的地方還在采用喬化砧木作為大櫻桃砧木，但櫻桃的產量比較低，因此加大優質矮化砧木的繁育，能大力推動云南大櫻桃產業發展。國內大櫻桃矮化砧木的繁育技術已有很多報道，如劉慶忠等［4-10］對大櫻桃矮化砧木吉塞拉系列進行了研究，但是關于不同誘導生根時間對吉塞拉6號生根及煉苗移栽成活率的影響，以及大櫻桃矮化砧木培養瓶外生根技術鮮有研究報道。

筆者將大櫻桃矮化砧木吉塞拉6號進行培養瓶外生根即基質扦插，整個過程不需要無菌操作，可以組織大量勞動力短期內完成扦插工作，生根后除去小拱棚，過渡一段時間后可直接上營養缽或進行大田移栽，這樣可以在一定程度上縮短育苗周期，并且有效地降低育苗成本，將大力促進大櫻桃矮化砧木吉塞拉6號優質種苗的規模化生產，進而推動我國大櫻桃產業的發展。

在本試驗中，雖然吉塞拉6號在粉碎苔蘚中的生根情況稍稍好點，但在松針粉中的生根率也較高，總體來看，松針粉的成本較低，因此在一些松針較豐富的地方，尤其在云南，可以因地制宜地選用松針粉作為吉塞拉6號的生根基質。

本試驗表明，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為吉塞拉6號較佳的初代培養莖段腋芽啟動培養基；MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為吉塞拉6號較佳的繼代增殖培養基；1/2 MS+0.5 mg/L IBA+2.0 g/L AC是吉塞拉6號較佳的生根培養基，生根培養第13天進行試管苗煉苗，第20天進行移栽，移栽后的成活率較高，為最佳的生根誘導和移栽時間；粉碎苔蘚是吉塞拉6號較好的瓶外生根基質。