苦豆子總堿二元醇脂質體制備及體外透皮特性研究*

王慧 邵青 張燕 王文杰 楊苗苗 胡婕雯 張玲

(1.西安市精神衛生中心,陜西 西安 710061;2.西安交通大學附屬紅會醫院,陜西 西安 710000)

苦豆子[1]為豆科植物苦豆子的種子,是西北很普遍的一種很重要的藥植資源。該品具有清熱去火,抑菌消炎等功效[2],常用于胃痛,宮頸糜爛,濕疹,頑癬等疾病。由于其不易透過皮膚一定程度制約了其外用制劑的開發與應用。

乙醇脂質體[3]含有較高濃度乙醇,在傳遞過程中使脂質體易變形,較易攜帶藥物進入皮膚深層,顯著增加藥物的滲透性,但由于乙醇易揮發,長期放置藥物容易泄漏,很大程度上限制了其在藥物研發中的應用。如果在乙醇脂質體制備過程中加入丙二醇[4-5],可能會因為粘度增大,從而增加乙醇脂質體的穩定性,鑒于此,本實驗在制備乙醇脂質體顯著提高苦豆子總堿的透皮量的基礎上,在處方中加入了丙二醇,制備二元醇脂質體,并對其包封率、體外透皮率、囊泡進入皮膚的深度及穩定性進行考察,篩選出乙醇與丙二醇的最佳配比。

1 儀器與材料

1.1儀器 LCZA型高效液相色譜儀系統(日本島津);Leica Tcs SpⅡ型激光共聚焦顯微鏡(德國徠卡有限公司);RC-3B型藥物溶出儀(天津市精拓儀器科技有限公司);TG20M型高速離心機(湖南郝西儀器設備有限公司),TK-12B型透皮擴散實驗儀(上海羅中科技發展有限公司)。

1.2試藥 苦豆子總生物堿原料藥(批號:040228,含量99.8%,寧夏紫荊花藥業);槐定堿標準品(批號:040228,食品藥品研究所);卵磷脂(PC上海愛康精細化工有限公司,含量90%);羅丹明B(Sigama公司);透析袋(截留分子量5000～8000,北京鵬成生物所分裝);甲醇是色譜純(Dima公司)。

1.3動物 昆明種小鼠,體重(20±4)g(許可證號SCXK(甘)14-006,合格證:醫動字第14-006號,蘭州大學動物實驗中心)。

2 方法

2.1制備二元醇脂質體 精密稱取3%(W/V)的苦豆子總堿、3%(W/V)PC和0.03%(W/V)羅丹明B溶于4.5 mL醇溶液中(乙醇∶丙二醇為10∶0,9∶1,7∶3,5∶5,3∶7,1∶9和0∶10,w/w),將PBS(pH 6.5)5.5 mL緩慢注入,整個過程在密閉恒溫容器中以700 r·min-1的轉速不斷攪拌20 min,制備過程中保持體系在(30±1)℃,室溫冷卻30 min,過濾[6],得不同比例乙醇與丙二醇的醇脂質體。

2.2苦豆子總堿中槐定堿的含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:三乙胺-甲醇-0.05mol·L-1磷酸二氫鈉(0.1∶20∶80);檢測波長:210 nm;柱溫:30 ℃,進樣量:10 μL。

2.2.2標準曲線及線性范圍 精密稱取6 mg的槐定堿標準品,置于10 mL容量瓶中,加甲醇溶液并定容,得對照品。精密量取該對照品,用甲醇將其稀釋成不同濃度的溶液(0.625、1.25、2.5、5、10和20 μg·L-1)。按“2.2.1”項下色譜條件,進樣分析,以峰面積(A)對濃度(C)進行回歸,線性回歸方程A=19448C+9811,r=0.9999,表明槐定堿在20～0.625 μg·L-1內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.3精密度及回收率試驗 精密量取槐定堿上述對照品,用甲醇將其稀釋成高、中、低(20、10、5 μg·L-1)的質量濃度的對照品溶液,測日內精密度(同日測定5次);測日間精密度(連續測定5 d)[7-8]。結果,平均日內及平均日間均小于5%(n=5),表明該方法精密度良好。計算樣品溶液的平均回收率為:(99.37±2.31)%,RSD小于2.62%,表明該方法回收率良好。

2.3醇脂質體形態的測定 將制得的二元醇脂質體樣品稀釋后,滴至有支持膜的銅網上,磷鉬酸染色后,室溫揮干,透射電鏡下觀察醇脂質體形態。

2.4粒徑及Zeta電位 將制得的二元醇脂質體以0.45 μm微孔濾膜過濾,激光動態光散射儀檢測樣品的粒徑大小及Zeta電位。

2.5包封率的測定 精密量取1 mL苦豆子總堿醇脂質體,加無水乙醇,超聲5 min,使醇脂質體完全破乳,無水乙醇稀釋到合適濃度,微孔濾膜過濾,HPLC法測定濾液,所測的藥物總濃度為C,將精密量取的等比例的醇相緩沖鹽體系溶液2 mL放于透析袋內作為內相,將精密量取的苦豆子總堿醇脂質體10 mL放于透析袋外作為外相,以500 r·min-1,(35±2)℃透析6 h[9-10]。精密量取1 mL透析袋內透析液,用等比例的醇相緩沖鹽溶液稀釋,微孔濾膜過濾,HPLC法測定濾液,所測的游離藥物濃度為CⅠ,計算不同比例乙醇與丙二醇的醇脂質體的包封率(EE%)為:EE%=(C-CⅠ)/C×100%。

2.6不同比例乙醇與丙二醇的醇脂質體的體外經皮滲透實驗的比較 采用Franz擴散池進行小鼠皮膚的滲透研究,取昆明小鼠,用剃刀小心地刮去背部毛發,從每只被處死的小鼠背部區域切除一塊皮膚,清洗,浸泡于生理鹽水,4℃保存,備用。給藥室上固定小鼠皮膚,在接收池中加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4),使得小鼠皮膚與接收液完全接觸。取醇脂質體各0.5 mL,滴于給藥室上的小鼠皮膚,以500 r·min-1的速度攪拌恒溫水浴池(35±2)℃,分別在0,1,2,3,6,7,10,12,24 h時間點取0.1 mL接收液,并在接收池中加入0.1 mL磷酸鹽緩沖液。將取得的接收液(0.1 mL)離心(10000 r·min-1)5 min,取1 μL進樣,測定含量[11-12]。

2.7觀察小鼠皮膚中醇脂質體分布

2.7.1給藥方法 制備含有1%羅丹明B的不同比例乙醇與丙二醇的醇脂質體,將醇脂質體涂抹于去毛的小鼠皮膚,12 h后,處死小鼠,剝離小鼠皮膚,放于載玻片,備用[13]。

2.7.2共聚焦激光掃描顯微鏡觀測 共聚焦激光掃描顯微鏡對載玻片上的備用皮膚進行斷層掃描。結果見圖3。

2.8醇脂質體穩定性考察 分別將制備的醇脂質體置于冰箱(4 ℃)及室溫下,每月測定其包封率,不間斷測定3個月,考察醇脂質體的穩定性[14-16]。

3 結果

3.1處方篩選 確定處方中乙醇與丙二醇的最佳比例。預實驗優化處方,當苦豆子總堿、醇相和磷脂分別為1%、45%和3%時,苦豆子總堿醇脂質體包封率相對最高,通過預實驗發現乙醇與丙二醇的配比對粒徑大小及包封率有很大的影響[17-18],對此,本實驗考察乙醇與丙二醇不同比例時粒徑大小及包封率的變化,結果見表1和表2。

表1 不同比例的乙醇與丙二醇制備苦豆子總堿醇脂質體

表2 不同比例乙醇與丙二醇的苦豆子總堿醇脂質體的粒徑、PI、Zeta電位和包封率

3.2醇脂質體透射電鏡圖 透射電鏡掃描苦豆子總堿醇脂質體(乙醇∶丙二醇=7∶3),見圖1。

圖1 醇脂質體(乙醇∶丙二醇=7∶3)透射電鏡掃描圖(×100000)

圖1可見:醇脂質體(乙醇∶丙二醇=7∶3)均呈類球形或球形的囊泡。

表1、表2可見:當乙醇∶丙二醇=7∶3時,醇脂質體粒徑最小(103.00±16.15)nm,包封率最高(89.13±0.42)%,Zeta電位最大(-50.00±6.00)mV。醇脂質體粒徑越小,包封率越高,越易攜帶藥物透皮吸收[19],而Zeta電位越大,表明電荷之間排斥越強,囊泡間凝聚力[20-23]降低,從而使醇脂質體更穩定,篩選出乙醇與丙二醇的最佳配比為7∶3。

3.3體外經皮滲透實驗 本實驗選用制備的苦豆子總堿醇脂質體進行體外經皮滲透實驗,其24 h離體皮膚累積滲透曲線見圖2。

從圖2可知,24 h后苦豆子總堿二元醇脂質體(乙醇∶丙二醇=7∶3)累計滲透百分數最高,結果表明:二元醇脂質體(乙醇∶丙二醇=7∶3)中藥物的滲透性均大于其他乙醇與丙二醇的配比。

3.4共聚焦激光掃描電鏡觀察醇脂質體在小鼠皮膚分布 對涂有羅丹明B的不同乙醇與丙二醇的醇脂質體小鼠皮膚進行斷層掃描,不同比例的乙醇和丙二醇都可以攜帶藥物進入皮膚,但圖C較其他圖而言皮膚深層的熒光強度最強,這表明醇脂質體(乙醇∶丙二醇=7∶3)可以增加藥物的透皮量及皮內滯留量。結果見圖3。

3.5苦豆子總堿醇脂質體穩定性考察 考察乙醇與丙二醇(7∶3)的醇脂質體在室溫下3個月的穩定性,并觀察外觀,粒徑大小和包封率的變化[24]。結果表明:在室溫下依次于0、1、2、3月末取樣,包封率分別為:89.13%、87.21%、85.06%;粒徑分別為:103.00 nm、109.00 nm、111.00 nm,表明苦豆子總堿醇脂質體(乙醇∶丙二醇=7∶3)的外觀、包封率及粒徑未發生較大變化,表面醇脂質體的穩定性良好,無統計學差異。

圖2 苦豆子總堿24小時離體皮膚累計滲透百分率

注:A.乙醇∶丙二醇10∶0;B.乙醇∶丙二醇9∶1;C.乙醇∶丙二醇7∶3;D.丙二醇5∶5;E.乙醇∶丙二醇3∶7;F.乙醇∶丙二醇1∶9;G.乙醇∶丙二醇0∶10

4 討論

本實驗為獲得含3%的穩定的苦豆子總堿醇脂質體,減少包封后的滲漏,在乙醇脂質體中加入不同比例的丙二醇,考察其體外穩定性和透皮試驗。最后選擇乙醇與丙二醇的比例為7∶3,因為它具有最高的包封率(89.13±0.42)%、較小的粒徑(103.00±16.15)nm、較小的PI(0.19±0.51)和最高的Zeta電位(-50.00±6.00)mV。囊泡越小,包被率越高,包被的藥物越容易通過皮膚。苦豆子總堿醇脂質體具有緩釋作用,這可能是因為苦豆子總堿在通過透析袋進入PBS之前要先穿透磷脂雙分子層,使苦豆子總堿緩慢而持續地釋放。為了研究醇脂質體在皮膚中的分布,目前有關醇脂質體的透皮機制研究主要采用熒光標記法,所用的磷脂熒光標記物為羅丹明B,其中熒光團通過化學鍵合與磷脂直接鍵合,通過觀察羅丹明B在小鼠體內的滲透情況,可以推測二元醇脂質體對皮膚的滲透程度[25],在激光共聚焦顯微鏡下觀察了小鼠皮膚外用羅丹明B醇脂質體24后皮膚各層熒光強度,從而對二元醇脂質體的透皮情況進行客觀評價,實驗表明,乙醇∶丙二醇7∶3時,羅丹明B透皮量和透皮深度最大。因此,考慮到含醇脂質體(乙醇∶丙二醇7∶3)的穩定性、較高的包封率、藥物的透皮百分比和穿透深度,乙醇與丙二醇7∶3的比例為醇脂質體處方的最佳配比。