基于成分定量和指紋圖譜的化學模式識別法評價膽木不同部位的差異性

彭 警，樊簫雨，王迪磊，徐 冰，張澤康，肖五慶，楊天姿，李鵬躍，杜守穎

基于成分定量和指紋圖譜的化學模式識別法評價膽木不同部位的差異性

彭 警，樊簫雨，王迪磊，徐 冰，張澤康，肖五慶，楊天姿，李鵬躍*，杜守穎*

北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488

建立膽木不同部位的UPLC指紋圖譜，結合成分定量與化學模式識別，評價膽木不同部位的差異性。采用Waters Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相進行梯度洗脫；檢測波長240 nm；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃，對膽木不同部位異長春花苷內酰胺的含量進行測定，利用化學模式識別法通過SPSS 20.0對色譜數據進行聚類分析和通過SIMCA 14.1軟件對膽木9部位進行主成分分析，并將所有色譜峰化為分類數據對藥材不同部位的差異性進行分析。對于異長春花苷內酰胺而言，植株地下部位（根皮、去皮根莖）的累積量要高于地上部位的累積量，在地下部位，根皮部位的含量高于去皮根莖部位的含量，地上部位中葉含量最高，其次為莖干部位，最后為枝部位，莖干部位趨勢從高到低大致為去皮莖干、帶皮莖干、莖皮，枝部位趨勢從高到低大致為枝皮、去皮枝莖、帶皮小枝。3批次9部位（27份）藥材UPLC圖譜有9個共有峰，指認了其中獐牙菜苷、綠原酸、馬錢苷酸3個色譜峰。當平方歐氏距離為10時，9部位被聚為3類：3批葉聚為一類，3批根皮、3批莖皮、3批枝皮共聚為一類，3批去皮根莖、3批帶皮莖干、3批去皮莖干、3批帶皮小枝、3批去皮枝莖聚為一類。所有色譜峰化為分類數據后，在皮部位中，根皮能區分于莖皮和枝皮，色譜圖中根皮也存在區別于莖皮和枝皮的特征峰；在去皮部位中，去皮根莖可區分于去皮枝莖和去皮莖干，色譜圖中去皮根莖也存在區別于去皮枝莖和去皮莖干的特征峰，同時去皮枝莖和去皮莖干可通過色譜圖中的特征峰區分開來；在帶皮部位中，帶皮小枝與帶皮莖干可以區分開來。膽木皮部位（根皮、枝皮、莖皮）、帶皮部位（帶皮小枝、帶皮莖干）、去皮部位（去皮莖干、去皮枝莖、去皮根莖）、葉部位存在差異，可為膽木的進一步開發利用提供依據。

膽木；指紋圖譜；異長春花苷內酰胺；主成分分析；獐牙菜苷；綠原酸；馬錢苷酸；正交偏最小二乘判別分析

膽木為海南地區傳統植物藥，又名藥烏檀、山熊膽、熊膽樹、黃羊木、黃膽木、黃心木、樹黃柏、細葉黃顆木，來源于茜草科烏檀屬植物烏檀Pierre ex Pitard.。該植物零星分布于我國廣東、廣西、海南、湖南等地，生于高山近頂或半腰蔭蔽潮濕地帶。膽木最早收錄于1969年廣州部隊的《常用中草藥手冊》，味苦，性寒，功效為清熱解毒，消腫止痛，用于治療急性扁桃體炎、咽喉炎、乳腺炎、腸炎、菌痢、尿路感染、膽囊炎、下肢潰瘍、腳癬感染、癤腫膿瘍、皮炎濕疹；后記載于1975年《全國中草藥匯編》[1]，味苦，性寒，功效為清熱解毒、消腫止痛，內服用于治療感冒發熱、急性扁桃體炎、咽喉炎、支氣管炎、肺炎、泌尿系感染、腸炎、痢疾、膽囊炎，外用用于治療治乳腺炎，癰癤膿腫；1977年收錄于《中國藥典》[2]，味苦、性寒，功效為清熱解毒，用于治療感冒發熱、咽喉腫痛、外耳道癤腫、急性結膜炎、皮膚癤腫；《廣東省中藥材標準》[3]2004年版中亦有收載，味苦，性寒，功效為清熱解毒、消腫止痛，用于治乳蛾、痢疾、下肢潰瘍、癤重膿瘍、濕疹。但四者關于膽木用藥部位的記載并不一致，《常用中草藥手冊》中記載以枝和樹皮入藥，《全國中草藥匯編》記載以枝、干、皮入藥，《中國藥典》1977年版記載以莖干及根入藥，《廣東省中藥材標準》記載以木材入藥。

目前對于膽木的研究文獻相對較少，已有研究顯示，膽木中含有喹諾酮類生物堿[4]，如短小蛇根草苷；酚酸類成分[5]，如對甲氧基桂皮酸、咖啡酸甲酯等；也含有黃酮類[6]、倍半萜類化合物[7]，但其含量最高的成分為喹啉酮類生物堿苷異長春花苷內酰胺。部分藥效實驗顯示，膽木提取物具有抗菌、抗病毒活性[8]，能夠降低血壓、減慢心率及延長QT間期[9]。相關研究也顯示不同生長年限和月份的膽木化學成分有差異[10]，不同部位藥理活性也有差異[11]，然而前述標準中或以莖干為原料，或以莖枝為原料，或以枝葉為原料，受入藥部位不一致的影響，已報道的各研究中所采用的“膽木”基原存在混淆，在一定程度上導致對膽木植株不同部位化學成分差異性的分析曖昧不明，為膽木的研究、開發或入藥基原的擴大帶來了困擾。

本研究擬建立膽木不同部位的的UPLC指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”軟件對3批次膽木的9個部位（根皮、去皮根莖、葉、去皮莖干、帶皮莖干、莖皮、枝皮、去皮枝莖、帶皮小枝）進行相似度評價，并運用SPSS 20.0進行聚類分析、運用SIMCA 14.1軟件進行主成分分析對膽木不同部位進行分類，并采用偏最小二乘判別法分析不同部位的差異性化學成分，為后續膽木的研究、利用及藥源的擴大提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

賽多利斯BSA 223S型分析天平（德國賽多利斯公司）；梅特勒-托利多MS105DU型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；ACQUITY型超高效液相色譜儀（美國沃特世公司）。

1.2 試藥

異長春花苷內酰胺（批號111778-202003，質量分數95.0%）、綠原酸（批號110753-202018，質量分數96.1%）、馬錢苷酸（批號111865-202005，質量分數97.5%），以上對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品獐牙菜苷（CAS：14215-86-2，批號P25O10F101344，質量分數≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司）。甲醇、乙腈和磷酸均為色譜純（美國Fisher公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。3批次9部位（共27份）膽木由海南森祺制藥有限公司提供，經北京中醫藥大學王晶娟教授鑒定為茜草科烏檀屬植物烏檀Pierre ex Pitard.的根皮、去皮根莖、葉、去皮莖干、帶皮莖干、莖皮、枝皮、去皮枝莖、帶皮小枝。藥材、飲片編號見表1，各批次根皮、去皮根莖、葉、去皮莖干、帶皮莖干、莖皮、枝皮、去皮枝莖、帶皮小枝均來自同一棵植株。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

分別精密稱定3批次9部位膽木藥材粉末0.5 g（過4號篩），分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率200 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱定對照品異長春花苷內酰胺12.20 mg、綠原酸9.94 mg、馬錢苷酸8.34 mg、獐牙菜苷10.32 mg分別置于10 mL量瓶，加甲醇定容后配制成對照品母液冷藏備用；使用前吸取1 mL對照品母液置于10 mL量瓶加甲醇定容稀釋為含異長春花苷內酰胺0.115 9 mg/mL、綠原酸0.095 5 mg/mL、馬錢苷酸0.081 4 mg/mL、獐牙菜苷0.101 1 mg/mL的對照品溶液。

2.3 色譜條件

Waters Acquity BEH C18色譜柱：（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫；0～2 min，6.0%～8.0% A；2～5 min，8.0%～10.0% A；5～7 min，10.0%～13.0% A；7～13 min，13.0%～21.0% A；13～15 min，21.0%～22.0% A；15～17 min，22.0%～29.0% A；17～20 min，29.0%～30.0% A；20～22.5 min，30.0%～36.0% A；檢測波長240 nm；體積流量0.3 mL/min；進樣量1 μL，柱溫30 ℃。

2.4 含量測定

2.4.1 線性關系考察 取“2.2”項下對照品溶液（含異長春花苷內酰胺0.115 9 mg/mL）適量，按“2.3”項下色譜條件分別進樣0.3、0.8、1.5、2.0、3.0、5.0 μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標（）、進樣量為橫坐標（）進行線性回歸，得回歸方程＝844.94－49.664，2＝0.999 7。結果表明在異長春花苷內酰胺進樣含量為0.034 8～0.579 5 μg時，線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗 取“2.2”項下對照品溶液（異長春花苷內酰胺0.115 9 mg/mL）適量，按“2.3”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果異長春花苷內酰胺的RSD為0.28%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取帶皮小枝藥材粉末（S25）約0.5 g，按“2.1”項下方法制備后分別在室溫下放置2、4、8、10、12、24 h時按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果異長春花苷內酰胺峰面積的RSD為0.53%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批帶皮小枝藥材粉末（S25）約0.5 g，平行6份，分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，結果，樣品中長春花苷內酰胺質量分數RSD為1.05%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已測定成分含量的帶皮小枝藥材粉末（S25）約0.25 g，共6份，分別按1∶1的質量比加入對照品溶液，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結果，異長春花苷內酰胺的平均加樣回收率為99.56%，RSD為2.27%，表明該方法準確度良好。

2.4.6 樣品測定 取3批次9部位膽木藥材粉末，按“2.1”項下方法平行制備供試品溶液各2份，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積，計算樣品中異長春花苷內酰胺含量，結果見表2。實驗結果顯示，在植株不同部位，異長春花苷內酰胺皆為累積量最高的成分，對于異長春花苷內酰胺而言，植株地下部位（根皮、去皮根莖）的累積量高于地上部位的累積量；在地下部位，根皮部位的含量高于去皮根莖部位的含量，但個別批次去皮根莖含量略高于根皮含量；地上部位中葉含量最高，其次為莖干部位，莖干部位異長春花苷內酰胺含量從高到低趨勢大致為去皮莖干＞帶皮莖干＞莖皮，但個別批次帶皮莖干含量高于去皮莖干；異長春花苷內酰胺的含量在枝部位累積較少，從高到低大致順序為枝皮＞去皮枝莖＞帶皮小枝，帶皮小枝藥材較為細小，推測異長春花苷內酰胺的積累可能與生長周期相關。

2.5 指紋圖譜方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取供試品帶皮小枝溶液（S25）適量，按“2.3”項下色譜條件連續進樣測定6次。以異長春花苷內酰胺峰為參照峰（S），計算各共有峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，各共有峰相對保留時間的RSD為0.07%～0.51%，相對峰面積的RSD為0.25%～2.10%，表明該方法精密度良好。

2.5.2 穩定性考察 取供試品帶皮小枝溶液（S25）適量，分別制備后在室溫下放置2、4、8、10、12、24 h時按“2.3”項下色譜條件進樣測定。以異長春花苷內酰胺峰色譜峰為參照峰（S），計算各共有峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.31%，相對峰面積的RSD為0.53%～2.66%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

表2 3批次膽木中異長春花苷內酰胺含量

2.5.3 重復性考察 取供試品帶皮小枝藥材粉末（S25）約0.5 g，精密稱定，平行6份，分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進樣測定。以異長春花苷內酰胺色譜峰為參照峰（S），計算各共有峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.42%，相對峰面積的RSD為0.59%～2.51%，表明該方法重復性良好。

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 膽木指紋圖譜的建立及共有峰的確認 取3批膽木9部位藥材粉末各0.5 g，分別按照“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定，獲取3批膽木9部位指紋圖譜，見圖1。將3批次9部位膽木藥材色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，以1號根皮為參照圖譜，采用中位數法多點校正后進行匹配，生成對照特征圖譜，按照峰面積大于最高峰峰面積0.1%和分離度大于1.5的條件共選定了10個共有峰。由于10號色譜峰（即含量最高的異長春花苷內酰胺）峰面積過大，而其他峰峰面積均較小，為了避免10號峰貢獻率太高，掩蓋峰面積較小的峰的差異而導致分析結果的誤差，因此后續分析中剔除了10號色譜峰。以對照圖譜為參照進行相似度評價，9部位總體相似度為0.837～0.999，表明不同批次不同部位膽木之間相似度較高。

圖1 膽木的UPLC特征指紋圖譜

2.6.2 主要色譜峰的指認 采用對照品對各峰進行指認，共指認出4個成分，1號峰馬錢苷酸，2號峰綠原酸，4號峰獐牙菜苷，10號峰異長春花苷內酰胺，見圖2。

1-馬錢苷酸 2-綠原酸 4-獐牙菜苷 10-異長春花苷內酰胺

2.7 化學模式識別

2.7.1 聚類分析 將9個共有峰峰面積導入SPSS 20.0軟件，以平方歐氏距離（Euclidean距離）為區間，采用Ward聯結法對3批次9部位膽木樣品進行聚類分析，結果如圖3所示，可以看出當平方歐氏距離為10時，9部位可以被聚為3類：3批葉（S7～S9）聚為一類；3批根皮（S1～S3）、3批莖皮（S16～S18）、3批枝皮（S19～S21）聚為一類；3批帶皮莖干（S13～S15）、3批帶皮小枝（S25～S27）、3批去皮根莖（S4～S6）、3批去皮莖干（S10～S12）、3批去皮枝莖（S22～S24）聚為一類。

圖3 3批次9部位膽木聚類分析樹狀圖

2.7.2 主成分分析 將3批次9部位膽木樣品的9個共有峰峰面積導入SIMCA 14.1軟件進行主成分分析。由主成分分析結果可知，前3個主成分的累積貢獻率為88.2%，前3個成分載荷值分別為4.830、2.110、0.997，說明前3個主成分基本能反映3批次9部位膽木樣品的主要特征，見表3、圖4。以前3個主成分建立坐標系，構建樣品的主成分分析得分圖，見圖5，由得分圖可知3批次9部位膽木可聚為3類，3批葉（S7～S9）聚為一類；3批根皮（S1～S3）、3批莖皮（S16～S18）和3批枝皮（S19～S21）聚為一類；3批帶皮莖干（S13～S15）、3批帶皮小枝（S25～S27）、3批去皮根莖（S4～S6）、3批去皮莖干（S10～S12）、3批去皮枝莖（S22～S24）聚為一類，與聚類分析結果一致。

2.7.3 偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA） 為了進一步比較3批次9部位膽木化學成分的差異和尋找各部位之前的差異性化合物，將3批次膽木9部位9個共有峰峰面積為變量進行了OPLS-DA建模分析。OPLS-DA模型中，2為0.77，2為0.852，均大于0.5，說明建立的模型穩定可靠。由OPLS-DA得分圖見圖6，3批次9部位膽木明顯分為3類。通過變量重要性投影值（variable importance for the projection，VIP）篩選出三者間化學成分差異的主要標志性成分，見圖7，橫坐標為峰號。以VIP部值大于1作為標準篩選，貢獻依次由大到小的4個變量為峰4、3、9、2、5。通過對照品對照，指認出2個成分，分別為峰4獐牙菜苷，峰2綠原酸。

表3 主成分特征值

圖4 主成分方差貢獻率

圖5 主成分得分分析圖

圖6 3批次9部位膽木OPLS-DA得分圖

圖7 3批次9部位膽木VIP圖

2.8 膽木藥材不同部位的差異性分析

在聚類分析中將所有樣本聚為3類，聚類I：3批次葉；聚類II：3批皮部位（根皮、莖皮、枝皮）；聚類III：帶皮部位（帶皮莖干、帶皮小枝）和去皮位（去皮根莖、去皮莖干、去皮枝莖）聚為一類。葉部位在聚類分析中與其他部位得到了區分，而在聚類II、聚類III中尚未能將根、莖、枝來源進行區分，擬在此基礎上采用特征峰予以分析，將根、莖、枝來源進行區分。

2.8.1 皮部位分析 將3批次膽木藥材皮部位（根皮、枝皮、莖皮）色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，進行共有峰匹配，確定22個共有峰，為了避免最高峰貢獻率太高，掩蓋峰面積較小的峰的差異而導致分析結果的誤差，分析中剔除了最高峰，見圖8。

圖8 3批次膽木皮部位UPLC特征圖譜

將3批次膽木皮部位樣品的22個共有峰峰面積導入SIMCA 14.1軟件進行主成分分析。由主成分分析結果可知，皮部位前4個主成分的累積貢獻率為89.0%，前4個成分載荷值分別為4.020、1.840、1.140、1.020，說明前4個主成分基本能反映3批次膽木皮部位樣品的主要特征，見表4；以皮部位前4個主成分建立坐標系，構建樣品的主成分分析得分圖，見圖9，由得分圖可知根皮（S1～S3）、莖皮（S16～S18）和枝皮（S19～S21）混在一起無法區分開來。為了進一步將膽木皮部位區分開來，將3批次皮部位膽木藥材所有峰峰面積化為分類數據，即相同保留時間下若存在色譜峰則設為1，若不存在色譜峰則設為0，導入SIMCA 14.1軟件進行主成分分析。由主成分分析結果可知，皮部位前4個主成分的累積貢獻率為79.7%，前4個成分載荷值分別為3.600、1.590、1.120、0.850，說明前4個主成分基本能反映3批次膽木皮部位樣品的主要特征，見表5。以皮部位前4個主成分建立坐標系，構建樣品的主成分分析得分圖，見圖10，由得分圖可知根皮（S1～S3）聚為一類，莖皮（S16～S18）和枝皮（S19～S21）無法區分開來。

表4 基于共有峰分類數據的皮部位主成分特征值及方差貢獻率

圖9 基于共有峰分類數據的皮部位主成分得分分析圖

表5 基于色譜峰分類數據的皮部位主成分特征值及方差貢獻率

圖10 基于色譜峰分類數據的皮部位主成分得分分析圖

結合色譜圖分析差異性，由根皮、枝皮、莖皮色譜圖（圖11）可知，峰a、d為枝皮和莖皮特有峰，峰b、c、e、f、g、h、i、j為根皮特有峰，根皮能夠顯著區別于枝皮和莖皮，而枝皮和莖皮之間沒有特異性峰，無法靠特異峰區分開來，與PCA分析結果一致。

圖11 膽木皮部位特征圖譜

2.8.2 去皮部位分析 將3批次膽木藥材去皮部位（去皮根莖、去皮枝莖、去皮莖干）色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，進行共有峰匹配，確定18個共有峰，為了避免最高峰貢獻率太高，掩蓋峰面積較小的峰的差異而導致分析結果的誤差，分析中剔除了最高峰，見圖12。

將3批次膽木去皮部位樣品的18個共有峰峰面積導入SIMCA 14.1軟件進行主成分分析。由主成分分析結果可知，去皮部位前4個主成分的累積貢獻率為84.3%，前4個成分載荷值分別為3.510、2.020、1.240、0.820，說明前4個主成分基本能反映3批次膽木去皮部位樣品的主要特征，見表6；以去皮部位前4個主成分建立坐標系，構建樣品的主成分分析得分圖，見圖13，由得分圖可知3批去皮根莖（S4～S6）聚為一類，3批去皮枝莖（S22～S24）聚為一類，而去皮莖干（S10～S12）混于二者之間，表明去皮根莖和去皮枝莖化學成分及含量存在較大差異，而去皮莖干無法和其他兩者區分開來。為了進一步將膽木去皮部位區分開來，將3批次去皮部位膽木藥材所有峰峰面積化為分類數據，即相同保留時間下若存在色譜峰則峰面積定為1，不存在色譜峰則峰面積定為0，導入SIMCA 14.1軟件進行主成分分析。由主成分分析結果可知，去皮部位前4個主成分的累積貢獻率為84.1%，前4個成分載荷值分別為3.540、2.000、1.280、0.760，說明前4個主成分基本能反映3批次膽木去皮部位樣品的主要特征，見表7。以去皮部位前4個主成分建立坐標系，構建樣品的主成分分析得分圖，見圖14，由得分圖可知3批去皮根莖（S4～S6）聚為一類，3批去皮莖干（S10～S12）和3批去皮枝莖（S22～S24）聚為一類，表明去皮根莖與去皮莖干和去皮枝莖化學成分及含量存在較大差異，而去皮莖干無法和去皮枝莖區分開來。結合色譜圖分析差異性 將第一批次去皮枝莖、去皮根莖、去皮莖干疊加后放大，見圖15，峰b、d、f、g為去皮枝莖和去皮莖干的特有峰，峰e為去皮根莖的特有峰，去皮根莖能顯著區別于去皮枝莖和去皮莖干，與主成分分析結果一致，

圖12 3批次膽木去皮部位UPLC特征圖譜

表6 基于共有峰分類數據的去皮部位主成分特征值及方差貢獻率

圖13 基于共有峰分類數據的去皮部位主成分得分分析圖

表7 基于色譜峰分類數據的去皮部位主成分特征值及方差貢獻率

圖14 基于色譜峰分類數據的去皮部位主成分得分分析圖

盡管色譜圖顯示，與去皮莖干部位相比，去皮枝莖有少量特有的色譜峰，但以共有峰數據和色譜峰分類化數據進行主成分分析，去皮莖干部位與去皮枝莖部位均有較好的相似性。

2.8.3 帶皮部位分析 將3批次膽木藥材帶皮部位（帶皮小枝、帶皮莖干）色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，進行共有峰匹配，確定了20個共有峰，為了避免最高峰貢獻率太高，掩蓋峰面積較小的峰的差異而導致分析結果的誤差，分析中剔除了最高峰，見圖16。

將3批次膽木帶皮部位樣品的20個共有峰峰面積導入SIMCA 14.1軟件進行主成分分析。由主成分分析結果可知，帶皮部位前3個主成分的累積貢獻率為86.5%，前3個成分載荷值分別為3.080、1.360、0.750，說明前3個主成分基本能反映3批次膽木帶皮部位樣品的主要特征，見表8。以帶皮部位前3個主成分建立坐標系，構建樣品的主成分分析得分圖，見圖17，由得分圖可知3批帶皮莖干（S13～S15）聚為一類，3批帶皮小枝（S25～S27）聚為一類，表明帶皮莖干和帶皮小枝化學成分及含量存在較大差異。

圖15 膽木去皮部位特征圖譜

圖16 3批次膽木帶皮部位UPLC特征圖譜

3 討論

3.1 提取方法及時間考察

以異長春花苷內酰胺的提取率為指標對提取方式、提取溶劑、提取時間進行了考察。先考察了甲醇回流提取和超聲提取的區別，結果發現對于主成分異長春花苷內酰胺而言，甲醇超聲組與甲醇回流組峰面積差異不大，故選擇采用超聲的方式進行提取。然后比較了水超聲和甲醇超聲提取的區別，對于主成分異長春花苷內酰胺而言，甲醇超聲提取率明顯高于水提，峰面積約是水提的1.5倍，因為要測定異長春花苷內酰胺含量，決定提取溶劑為甲醇。接著考察了不同超聲時間的區別，對比了超聲30 min和超聲45 min的區別，結果發現隨超聲時間延長，主成分異長春花苷內酰胺和其他各高峰峰面積變化不大，平行性良好，決定超聲時間為30 min。

表8 帶皮部位主成分特征值及方差貢獻率

圖17 帶皮部位主成分得分分析圖

3.2 色譜條件的考察

本實驗也考察了不同流動相洗脫時的分離結果，對比了0.1%甲酸和0.1%磷酸洗脫時色譜峰的差異，綜合考慮色譜峰峰形較好且基線較為平穩，最終確定流動相為0.1%磷酸。然后以0.1%磷酸為流動相分別比較226、240、258、285 nm下樣品以及甲醇的色譜圖，考察不同波長下溶劑甲醇對樣品色譜圖出峰結果的影響，結果發現，258 nm與285 nm下各峰面積均較低，226 nm下溶劑峰干擾較為顯著，影響后續指紋圖譜工作的進行，為了盡可能獲得較全、小峰較高的指紋圖譜且降低溶劑峰的干擾，最終確定檢測波長為240 nm。

本研究以膽木不同部位藥材為對象，建立了不同部位膽木藥材的UPLC指紋圖譜及UPLC測定異長春花苷內酰胺含量的方法，該方法耗時短、效率高、方法學驗證合格。通過分析，9部位總體可分為3大類，分別為皮部位、葉部位、帶皮和去皮部位，3大類之間化學成分和含量存在較大差異。皮部位細分后可分為2大類，根皮一類，莖皮和枝皮一類，2大類之間化學成分和含量存在較大差異，色譜圖分析結果顯示根皮顯著區別于莖皮和枝皮，而莖皮和枝皮無法通過色譜圖分開分開。去皮部位細分后可分為2大類，去皮根莖一類，去皮枝莖和去皮莖干一類，2大類之間化學成分和含量存在較大差異，色譜圖分析結果顯示去皮根莖顯著區別于去皮枝莖和去皮莖干，同時去皮枝莖和去皮莖干可以靠特征峰分開。帶皮部位細分后可分為2大類，分別為帶皮小枝和帶皮莖干，2大類之間化學成分和含量存在較大差異，聚類分析及主成分分析結果可為膽木的用藥部位的差異性比較提供參考。

皮部位和去皮部位主成分分析時采用了將所有色譜峰峰面積化為分類數據進行分析的方法，現存文獻多以共有峰進行主成分分析，如鐘海蓉等[12]建立了不同產地不同部位川赤芍根、莖、葉的UPLC指紋圖譜，共標定了17個共有峰，結果顯示川赤芍各部位的化學成分極為相似，且莖和葉化學成分含量較接近，說明不同產地川赤芍根藥材質量存在顯著差異。洪婉敏等[13]對不同部位仙鶴草地上部分、莖、葉建立了指紋圖譜，各標定了20、16、14個共有峰，結果顯示仙鶴草葉可大致聚為一類，地上部分與莖多聚為一類，表明仙鶴草地上部分與莖化學成分較接近，而與葉的化學成分差異相對較大。吳佳等[14]建立了不同部位藤茶普葉和龍須的指紋圖譜，確定了10個普葉中共有峰和12個龍須中共有峰，結果顯示，藤茶不同部位即龍須和普葉組間差異遠大于組內差異，龍須和普葉分類明顯。與現存文獻中普遍使用的共有峰PCA法相比，將所有色譜峰轉化為分類數據進行分析能更好的體現差異性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Differences ofin different parts based on quantitative analysis of components and fingerprint by chemical pattern recognition

PENG Jing, FAN Xiao-yu, WANG Di-lei, XU Bing, ZHANG Ze-kang, XIAO Wu-qing, YANG Tian-zi, LI Peng-yue, DU Shou-ying

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To establish UPLC fingerprint of different parts of, and evaluate the quality of different parts ofby combining composition quantification and chemical pattern recognition.Waters Acquity BEH C18column (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) was used. Gradient elution was carried out with acetonitrile (A)-0.1% phosphoric acid aqueous solution (B) as mobile phase. Detection wavelength: 240 nm; Flow rate: 0.3 mL/min; The contents of strictosamide in different parts ofwere determined at 30oC. Cluster analysis of chromatographic data was performed with SPSS 20.0 by chemical pattern recognition method and principal component analysis was performed with SIMCA 14.1 software for nine parts of.The accumulation of strictosamide in the underground part of the plant (root bark, peeled root) was higher than that in the aboveground part, in the underground part, the content of the root bark part was higher than that of the peeled root, but the content of the peeled root was slightly higher in individual batches, in the aboveground part, the leaf part was the highest, followed by the stem part and the last was branch part, the trend of stem part from high to low was about peeled stem, stem and stem bark, but the content of individual batches of stems was higher than that of peeled stems, and the trend of branch part from high to low was branch bark, peeled branch and branchlet. Nine common peaks were identified, three of which were identified as sweroside, chlorogenic acid and loganic acid. When the squared Euclidean distance was 10, nine parts can be well separated, three batches of leaves clustered into one class, three batches of root bark, three batches of stem bark and three batches of branchlets bark clustered into one class, three batches of stem, three batches of branchletslets, three batches of peeled root, three batches of peeled stem and three batches of peeled branchlets clustered into one class. After all chromatographic peaks were classified, the root bark could be distinguished from the stem bark and the branchlets bark, and the characteristic peaks were also distinguished from the stem bark and the branchlets bark. Among the peeled parts, peeled root could be distinguished from peeled branchlets and peeled stem. The characteristic peaks of peeled root could also be distinguished from peeled branchlets and peeled stem, at the same time, peeled branchlets could also be distinguished from peeled stem by the characteristic peaks of chromatogram. In the parts with skin, branchletslets with skin can be distinguished from stems with skin.There are differences in the parts of bark (root bark, branchlets bark, stem bark), parts with with skin (branchletslets with skin, stem with skin), peeled parts (peeled stem, peeled branchlets, peeled root) and leaves, which can provide basis for further development and utilization of gallbladder.

Pierre ex Pitard.; fingerprint; strictosamide; principal component analysis; sweroside; chlorogenic acid; loganic acid; orthogonal partial least squares discriminant analysis

R286.2

A

0253 - 2670(2023)10 - 3281 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.025

2022-10-09

彭 警（1998—），男，碩士在讀，從事中藥新劑型與新技術研究。Tel: 13535655204 E-mail: tcmpengjing@163.com

李鵬躍，博士，副教授，從事中藥新劑型與新技術研究。Tel: (010)53912123 E-mail: pengyuelee@126.com

杜守穎，博士，教授，從事中藥新劑型與新技術研究。Tel: (010)84738615 E-mail: Dushouying@263.net

[責任編輯 時圣明]