基于肝脂調控為核心的中藥調血脂活性和評價方法研究

李建超，鐘 穎，李榮榮，宋緒鈺，黃娜娜，孫 蓉, 3*

基于肝脂調控為核心的中藥調血脂活性和評價方法研究

李建超1, 2，鐘 穎2，李榮榮1, 2，宋緒鈺2，黃娜娜2，孫 蓉2, 3*

1. 山東中醫藥大學，山東 濟南 250355 2. 山東大學第二醫院，山東 濟南 250033 3. 山東大學高等醫學研究院，山東 濟南 250012

構建適宜于評價中藥以“肝脂調控”為核心的調血脂活性和評價的“多細胞來源”“穩定性好”的非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）體外細胞模型，以利于精準發現中藥脂代謝調控活性物質并評價其調血脂藥理學作用特征。選擇人肝癌HepG2細胞系及小鼠肝實質AML12細胞系，對造模試劑（油酸及棕櫚酸）、造模方法、作用濃度以及作用時間和溶媒選擇進行文獻和實驗研究，并以CCK-8及油紅O實驗確定最佳造模濃度，進而循形人體肝脂代謝輪廓，采用Western blotting法檢測細胞中脂代謝相關蛋白的表達情況，作為模型評價標準。經文獻和實驗研究發現，10%無脂肪酸牛血清白蛋白（fatty acid free bovine serum albumin，BSA）為油酸溶媒，20% BSA為棕櫚酸溶媒穩定性好；500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸（體積比2∶1）造模，作用24 h，可顯著增加細胞內脂質積累（＜0.001），且不影響細胞活性，證明造模成功；單獨使用棕櫚酸造模，對2種細胞損傷都較大，模型不適宜于調血脂物質發現與評價；500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸造模后，脂肪從頭合成相關蛋白固醇調節元件結合蛋白-1（sterol regulatory element-binding protein-1，SREBP-1）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）及脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）的表達無顯著變化，脂肪分解相關蛋白三酰甘油脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）的表達顯著升高（＜0.05、0.001），激素敏感脂肪酶（hormone sensitive lipase，HSL）的磷酸化顯著降低（＜0.05、0.01），脂肪酸氧化相關蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα）的表達無顯著差異，肉堿棕櫚酰轉移酶1A（carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A）的表達顯著增加（＜0.05）。500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸（體積比2∶1）造模24 h，均可顯著增加HepG2、AML12細胞中的脂質積累，成功構建NAFLD體外細胞模型，且具有穩定、經濟、高效的特點。

肝脂代謝；體外模型；非酒精性脂肪性肝病；游離脂肪酸；油酸；棕櫚酸

脂代謝功能紊亂是指長期能量攝入與代謝失衡導致大量脂質堆積，引起內分泌環境紊亂和異位脂質積累，導致脂毒性代謝應激，進而促進肝臟、脂肪組織和骨骼肌等靶器官的代謝功能失調與慢性炎癥[1]。肝臟是參與脂肪代謝的主要器官，作為脂質平衡的中心調節器，是脂蛋白攝取、形成、輸出和循環的主要加工中心[2-3]。非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver diseases，NAFLD）是指5%～10%的肝細胞出現大泡狀脂肪變性，或肝內三酰甘油（triglyceride，TG）質量分數超過5.5%[4]。NAFLD已經發展成為全球最常見的慢性肝病，且增長迅速，約25%的人口患有NAFLD[5-6]。近年來，我國的NAFLD發病率明顯上升，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。高發病率的NAFLD嚴重影響了人類的生活健康，給社會造成沉重的經濟負擔。因此，有效調控肝脂代謝穩態的治療手段在當下社會顯得愈發重要[6]。

中醫本無NAFLD的病名，其最早記載于《難經》中，屬于中醫“肝癖”“痰證”“脅痛”“積聚”等范疇，調肝化濁、健脾利濕、養血柔肝等是其有效治法[7-10]。鑒于目前西醫臨床針對NAFLD尚缺乏特效治療策略，亟需在中醫藥臨床豐富的有效經驗中發現并開發創新中藥。目前NAFLD動物模型制備存在造模時間長、價格昂貴現象，不適宜于中藥調控肝脂代謝的活性成分高效篩選，體外細胞模型構建方法統一性較差，如細胞系選擇、油酸及棕櫚酸造模濃度、單用還是合用、溶媒選擇、造模時間及評價指標等方面，文獻各不相同，差異較大。因此，亟需建立與臨床發病機制相吻合、適宜于以“肝脂調控”為核心的中藥調血脂活性和評價方法研究，且不同細胞來源的穩定、經濟、高效的NAFLD體外細胞模型，以更好地適應創新中藥發現、不同藥理學特征的評價研究，也為建立統一的模型標準提供數據支撐。

1 材料

1.1 細胞系

小鼠肝實質細胞AML12細胞系購自中國科學院干細胞庫，人肝癌HepG2細胞系購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 藥品與試劑

油酸（批號30138518）、棕櫚酸（批號30139518）購自上海國藥集團化學試劑有限公司；青霉素-鏈霉素（批號S110JV）、DMEM/F12（1∶1）培養基（批號L310KJ）、胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑（批號S450J7）購自上海源培生物科技股份有限公司；DMEM培養基（批號C11995500BT）、胎牛血清（批號A3160801）購自美國Gibco公司；地塞米松（批號D1756）、油紅O（批號O0625）購自美國Sigma公司；無脂肪酸牛血清白蛋白（fatty acid free bovine serum albumin，BSA，批號ST025）、蛋白酶抑制劑混合物（批號P1050-1）、磷酸酶抑制劑混合物（批號P1050-2）購自上海碧云天生物技術有限公司；CCK-8試劑盒（A311-02）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號E112-01）、高敏型ECL化學發光檢測試劑盒（批號E412-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；TG測定試劑盒（批號A110-1-1）購自南京建成生物工程研究所；酮體含量檢測試劑盒（批號BC5065）購自北京索萊寶科技有限公司；固醇調節元件結合蛋白-1（sterol regulatory element-binding protein-1，SREBP-1）一抗（批號ab28481）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα）一抗（批號ab126285）、肉堿棕櫚酰轉移酶1A（carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A）一抗（批號ab234111）購自英國Abcam公司；乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）一抗（批號3676S）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）一抗（批號3180S）、三酰甘油脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）一抗（批號2138S）、激素敏感脂肪酶（hormone sensitive lipase，HSL）一抗（批號4107S）、磷酸化HSL（phosphorylated HSL，p-HSL）一抗（批號45804S）購自美國CST公司；β-肌動蛋白（β-actin）一抗（批號20536-1-AP）購自美國Proteintech公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號GB23303）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器

精密電子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；CKX53型倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司）；HH-S型恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器廠）；5200型全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）；Multiskan Go-1510型全波長酶標儀、3111型CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SDS PAGE凝膠電泳及轉膜電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 文獻檢索

檢索中國知網（CNKI）中以HepG2為細胞模型，研究中藥調血脂活性的期刊文獻，以“NAFLD”“HepG2”為主題詞，時間為2018年1月1日至2023年2月4日；以“NAFLD”“HepG2”“Traditional Chinese Medicine”為主題詞在PubMed數據庫中搜索近5年文獻，通過閱讀標題與摘要首先排除與中藥、中藥方劑及中藥活性成分研究無關的文獻；然后進行全文閱讀，篩選出明確標識造模方法的文獻納入統計。

2.2 油酸、棕櫚酸儲存液的配制

將油酸加入到0.1 mol/L NaOH溶液中，置于75 ℃水浴鍋中皂化30 min，得20 mmol/L油酸溶液，之后加入到等體積的20% BSA溶液中充分混勻，得10 mmol/L油酸儲存液（含10% BSA）。

將棕櫚酸加入到0.1 mol/L NaOH溶液中，置于75 ℃水浴鍋中皂化30 min，得40 mmol/L棕櫚酸溶液，之后加入到等體積的40% BSA溶液中充分混勻，得20 mmol/L棕櫚酸儲存液（含20% BSA）。

將儲存液于超凈臺中過0.22 μm微孔濾膜，置于4 ℃冰箱保存。使用時用相應的細胞培養基稀釋至所需濃度，油酸＋棕櫚酸組為油酸與棕櫚酸體積比2∶1配制。

2.3 細胞培養

AML12細胞用含10%胎牛血清、1%胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑、1%青霉素-鏈霉素、40 ng/mL地塞米松的DMEM/F12培養基培養；HepG2細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基培養。細胞于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗。

2.4 CCK-8實驗

細胞以1×106個/mL接種于96孔板中，貼壁生長24 h，設置對照組、油酸組、棕櫚酸組和油酸＋棕櫚酸組，對照組僅加入培養基，其余各組分別加入125、250、500、800、1000 μmol/L相應藥物，繼續培養24 h，用CCK-8試劑盒測定細胞活力。

2.5 油紅O實驗

細胞以1×106個/mL接種于12孔板中，貼壁生長24 h，設置對照組、油酸組和油酸＋棕櫚酸組，對照組僅加入培養基，其余各組分別加入125、250、500、800、1000 μmol/L相應藥物，繼續培養24 h。用4%多聚甲醛固定30 min，在60%異丙醇中孵育2 min。然后在37 ℃下用60%油紅O染色20 min，60%異丙醇脫色15 s后，在磷酸鹽緩沖液中漂洗3次。采用倒置生物顯微鏡拍攝圖片。染色后的樣品在100%異丙醇中室溫搖晃30 min，提取油紅O，在510 nm處測定吸光度（）值。

2.6 TG及酮體含量檢測

細胞以1×106個/mL接種于6孔板中，貼壁生長24 h，設置對照組、油酸組和油酸＋棕櫚酸組，對照組僅加入培養基，其余各組分別加入500 μmol/L相應藥物，繼續培養24 h。按說明書要求，收取培養基上清液檢測酮體含量，收集細胞勻漿檢測細胞內TG含量。

2.7 Western blotting檢測脂代謝相關蛋白表達

細胞以1×106個/mL接種于6孔板中，貼壁生長24 h，設置對照組、油酸組和油酸＋棕櫚酸組，對照組僅加入培養基，其余各組分別加入500 μmol/L相應藥物，繼續培養24 h。收集細胞，加入RIPA緩沖液裂解，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉，封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗，4 ℃孵育1.5 h；最后使用ECL化學發光檢測試劑盒，在全自動化學發光圖像分析系統中顯影[11]。

2.8 統計學分析

3 結果

3.1 利用HepG2細胞建立NAFLD模型的應用現狀

HepG2細胞是人肝癌細胞，保留了正常肝細胞的糖脂代謝功能，是應用最廣泛的NAFLD體外模型之一[12]。利用CNKI數據庫，以“NAFLD”“HepG2”為主題詞搜索最近5年期刊文獻106條，篩選出與中藥脂代謝研究相關且明確標識造模方法的文章49篇，利用PubMed數據庫，搜索最近5年期刊文獻64條，篩選出有效文章38篇。其中單獨使用油酸造模的24篇，占28%；單獨使用棕櫚酸造模的20篇，占23%；使用油酸＋棕櫚酸造模的43篇，占49%。造模所用濃度從100～1000 μmol/L不等。造模或造模同時給藥作用時間多為24 h，約占91%。

3.2 不同濃度脂肪酸對肝細胞活性的影響

3.2.1 對HepG2細胞活性的影響 采用125～1000 μmol/L油酸、棕櫚酸、油酸＋棕櫚酸處理HepG2細胞，作用24 h，可見不同濃度的脂肪酸均可濃度相關性地降低HepG2細胞活力。油酸濃度達到800 μmol/L時，細胞活性顯著降低（＜0.001）。棕櫚酸濃度達到125 μmol/L時，細胞活性顯著降低（＜0.01），說明棕櫚酸對細胞的損傷更大。油酸＋棕櫚酸濃度達到1000 μmol/L時，細胞活性才出現顯著降低（＜0.001），說明油酸可一定程度抑制棕櫚酸對細胞的傷害（圖1-A）。

3.2.2 對AML12細胞活性的影響 采用125～1000 μmol/L油酸、棕櫚酸、油酸＋棕櫚酸處理AML12細胞，作用24 h，可見油酸濃度達到800 μmol/L時，細胞活性出現顯著降低（＜0.01）。棕櫚酸濃度達到500 μmol/L時，細胞活性顯著降低（＜0.001）。油酸＋棕櫚酸濃度達到1000 μmol/L時，細胞活性仍沒有表現出顯著降低（圖1-B）。相較于HepG2細胞來說，脂肪酸對AML12細胞的傷害更小。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.3 不同濃度脂肪酸對肝細胞脂肪超載的影響

3.3.1 對HepG2細胞脂肪超載的影響 采用125～1000 μmol/L油酸、油酸＋棕櫚酸處理HepG2細胞24 h，細胞固定后，進行油紅O染色，可見油酸、油酸＋棕櫚酸均呈濃度相關性地增加HepG2細胞的脂質積累（＜0.05、0.01，圖2-A）。結合CCK-8實驗結果，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸在未導致HepG2細胞活力明顯下降的情況下，成功誘導了NAFLD細胞模型。接著檢測干預后細胞內TG的含量，發現與對照組比較，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸均可顯著增加HepG2細胞內TG積累（＜0.001，圖2-B）。

3.3.2 對AML12細胞脂肪超載的影響 采用125～1000 μmol/L油酸、油酸＋棕櫚酸處理AML12細胞24 h，細胞固定后，進行油紅O染色，可見油酸、油酸＋棕櫚酸均呈濃度相關性地增加AML12細胞的脂質積累（＜0.01、0.001，圖2-C）。結合CCK-8實驗結果，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸在不影響AML12細胞活力的情況下，成功誘導了NAFLD細胞模型。同樣的，如圖2-D所示，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸可顯著增加AML12細胞中TG含量（＜0.001）。

由于棕櫚酸對2種細胞的損傷都較大，且低劑量的棕櫚酸并不足以誘導2種細胞產生顯著的脂質堆積。所以按照當前棕櫚酸配制方法，并不推薦單獨使用棕櫚酸構建NAFLD細胞模型。

3.4 不同濃度脂肪酸對脂代謝的影響

3.4.1 對脂肪從頭合成（De novo lipogenesis，DNL）的影響 如圖3-A所示，與對照組比較，500 μmol/L油酸組和500 μmol/L油酸＋棕櫚酸組的HepG2細胞中SREBP-1、ACC及FASN的蛋白表達沒有出現顯著升高。同樣的，在AML12細胞中也未觀察到顯著差異。表明在此模型中，脂肪酸的引入并沒有顯著激活肝臟DNL的生理過程。

3.4.2 對脂肪分解的影響 接著對調控肝細胞脂肪分解速率的蛋白進行了檢測，結果表明，在2種細胞系的細胞模型中，ATGL蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.001），而HSL的磷酸化水平顯著降低（＜0.05、0.01，圖3-B）。說明肝細胞中脂肪超載激活TG第一步水解的同時抑制了脂肪酸的進一步生成，HSL活性的降低促使肝細胞中脂質的進一步積累。

圖2 不同濃度脂肪酸對HepG2細胞(A、B) 及AML12細胞(C、D) 油紅O染色及細胞內TG累積的影響(, n = 3)

A-脂肪從頭合成相關蛋白表達 B-脂肪分解相關蛋白表達 C-脂肪酸氧化相關蛋白表達 D-酮體含量

3.4.3 對脂肪酸氧化的影響 如圖3-C所示，在HepG2細胞模型中，與對照組比較，油酸組和油酸＋棕櫚酸組的PPARα蛋白表達水平雖然存在降低趨勢但未出現顯著差異，CPT1A蛋白表達水平顯著升高（＜0.05），表明過量的脂肪酸促進了肝細胞中脂肪酸的氧化。在AML12細胞模型中觀察到同樣的現象。為了進一步說明脂肪酸氧化的變化，檢測了細胞培養基中酮體含量的變化情況，發現在HepG2細胞和AML12細胞中，500 μmol/L油酸和500 μmol/L油酸＋棕櫚酸均顯著升高了酮體的含量（＜0.001，圖3-D）。

4 討論

NAFLD是指除酒精外和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征的臨床病理綜合征[13]。游離脂肪酸可用于肝臟攝取和再酯化為TG，是肝中TG庫的主要來源，在NAFLD的發生發展中起著重要作用[14]。棕櫚酸和油酸是最豐富的游離脂肪酸，與正常人群相比，NAFLD患者血漿中棕櫚酸和油酸的含量顯著增加[15]。研究表明棕櫚酸對肝細胞有顯著的細胞毒性效應，通過聯合油酸可減輕細胞損傷[16]。

文獻研究發現，目前在以肝脂調控為核心的中藥調血脂活性物質發現和評價中所使用的模型較為多樣，統一性較差。HepG2細胞是人肝癌細胞，具有生長速度快、易于培養、脂滴形態學變化明顯等特點，被廣泛用于肝脂代謝的研究中[12]。AML12細胞是小鼠正常肝細胞，屬于永生化細胞，具有穩定的表型，存在過氧化物酶體和膽小管樣結構，更容易標準化，適用于多種肝臟疾病的研究[17]。本研究利用油酸、棕櫚酸在體外分別誘導人源HepG2細胞及鼠源AML12細胞脂肪變性，并通過檢測脂代謝相關蛋白的表達闡釋模型特點。

在造模時間的選擇上，根據不同的實驗目的，多選擇1～48 h，其中應用最多的為24 h（占94%）[18-21]。根據中藥的作用特點、細胞生長周期及前期實驗結果，選擇24 h作為本研究中2種細胞模型的造模時間。另外，目前可供選擇的脂肪酸溶媒也較多，文獻中多存在對溶媒表述不清的現象。常使用的包括甲醇、乙醇、二甲亞砜等有機溶劑，但都對細胞有較大的毒性作用，且溶解不充分，導致模型穩定性差。本研究選擇毒性較小的BSA作為溶媒，可與游離脂肪酸穩定結合，同時更加符合脂肪酸在體內的運輸特點[22]。實驗結果表明，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸干預細胞24 h后，在不影響細胞活性的情況下能夠顯著增加細胞內脂質積累。雖然在800 μmol/L甚至更高濃度的油酸＋棕櫚酸組中HepG2細胞及AML12細胞的活力仍未下降，但綜合考慮藥效驗證敏感性，選擇500 μmol/L作為構建NAFLD體外模型的最佳劑量，在此濃度下，繼續驗證了脂代謝相關蛋白的表達情況。

DNL主要發生在肝臟中[23]。乙酰輔酶A在ACC的作用下轉化為丙二酰輔酶A，繼而通過FASN轉化為脂肪酸主要為棕櫚酸，最終經過延長、酯化等步驟形成TG[23-24]。研究發現，NAFLD患者的DNL速率顯著增加，是導致肝臟脂質沉積的主要因素之一[25]。患者肝臟脂肪中15%～38%的棕櫚酸酯來自DNL，顯著高于正常群體[26]。一方面大量棕櫚酸的產生可引發炎癥和細胞凋亡；另一方面DNL的上調促使細胞轉向合成代謝而不是分解代謝，導致肝臟脂質堆積[4]。SREBP-1是DNL速率的主要調控因子，在NAFLD患者中表達增強，同時促進ACC及FASN的表達[23]。在本研究的模型中，SREBP-1、ACC及FASN的表達并未出現顯著升高。培養基中添加大量的游離脂肪酸使得DNL進程并未激活。

脂肪分解是TG分解為非酯化游離脂肪酸及甘油進入體循環的生理過程[4]。其中，ATGL是水解TG的第一步，也是限速步驟，生成甘油二酯和脂肪酸[27]。研究表明，肝臟中ATGL的缺失可以減輕肝臟炎癥及內質網應激，減緩病程的發展[19]。HSL是一種多功能的酶，主要調控二酰甘油酯的分解，其蛋白磷酸化可顯著激活蛋白活性，促進脂解速率[28-29]。最后，單甘酯脂肪酶（monoglyceride lipase，MGL）將單酰甘油水解為甘油和脂肪酸。ATGL、HSL和MGL的生理活性受不同蛋白質和輔助激活劑的相互調節，共同確保脂解速率以適應代謝需要[30]。在本研究的模型中，過量TG的積累顯著促進了肝細胞中ATGL的表達，以激活TG水解的第一步。然而，過量的游離脂肪酸負向調控了進一步的脂解過程，抑制HSL的磷酸化。

氧化供能是肝內脂肪酸代謝的主要途徑。脂肪酸的氧化由PPARα調節，長鏈脂肪酸依賴位于外膜的CPT1進入線粒體中[1,31]。PPARα的激活誘導了線粒體、過氧化物酶體和細胞色素中脂肪酸氧化相關基因的轉錄[32]。然而，這些過程會產生相當數量的活性氧、氧化應激和有毒的二元酸，進一步促進炎癥產生[33]。丙酮是肝臟中脂肪酸氧化的中間產物，包括乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酮。在2種模型中，酮體的含量顯著升高，PPARα的表達呈降低趨勢，但未出現顯著差異，CPT1A的表達呈現不同程度的顯著增加，說明細胞中多余的脂肪酸大量進入線粒體中，易造成線粒體DNA的氧化損傷，加劇線粒體功能障礙和氧化應激。

從上述結果可以看出，人源肝癌細胞HepG2與鼠源正常肝細胞AML12所建立的模型差異并不明顯，在不超生理濃度的情況下，細胞內脂質積累均隨脂肪酸濃度的增加而增加；但與HepG2細胞相比，AML12細胞對脂肪酸引起的細胞毒性耐受力更強，尤其是單獨使用棕櫚酸時，在濃度達到250 μmol/L時，細胞活性仍未出現顯著差異。從TG檢測可以看出，在相同的作用條件下AML12的脂質積累更加嚴重，說明AML12細胞對脂肪酸變化更加敏感。

本實驗選用的脂肪酸濃度相對較低，對細胞傷害較小。因此，更加適宜于反映NAFLD疾病初期病理特征，對于后續疾病出現的炎癥及細胞損傷，可采用更高劑量的脂肪酸進行誘導；另外，實驗采用單一因素即脂肪酸濃度增加作為造模條件，不能全面反映NAFLD臨床中復雜的多重致病因素[34]，因此，在藥物發現或藥效評價中可根據需求，注意結合其他體外模型進行交互驗證。

綜上，500 μmol/L油酸、500 μmol/L油酸＋棕櫚酸（體積比2∶1）作用于HepG2細胞及AML12細胞可成功誘導NAFLD體外細胞模型，影響肝細胞脂肪分解和脂肪酸氧化相關蛋白的表達，具有脂質堆積穩定、成模周期較短、經濟高效的特點。適用于中藥及中藥方劑中調血脂活性物質的廣泛篩選，為有效治療NAFLD的創新中藥發現及不同藥理學特征的評價研究提供模型參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Lipid-regulating activity and evaluation method of traditional Chinese medicine based on liver lipid regulation

LI Jian-chao1, 2, ZHONG Ying2, LI Rong-rong1, 2, SONG Xu-yu2, HUANG Na-na2, SUN Rong2, 3

1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 2. The Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033, China 3. Shandong University, Institute of Advanced Medical Sciences, Jinan 250012, China

To construct ancell model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) with “multi-cell origin” and “good stability”, which is suitable for lipid-regulating activity and evaluation with “liver lipid regulation” as the core of traditional Chinese medicine, so as to facilitate the accurate discovery of lipid-regulating active substances of traditional Chinese medicine and evaluate their pharmacological effects of lipid regulation.HepG2 cell line of human hepatocellular carcinoma and AML12 cell line of mouse liver parenchyma were selected, modeling reagents (oleic acid and palmitic acid), modeling methods, action concentration, action time and solvent selection were studied by literature and experiments. CCK-8 and oil red O experiments were used to determine the optimal modeling concentration, and then the contour of human liver lipid metabolism was followed. The expressions of lipid metabolism-related proteins in cells was detected by Western blotting as a model evaluation standard.It was found that 10% fatty acid free bovine serum albumin (BSA) was oleic acid solvent and 20% BSA was palmitic acid solvent with good stability. 500 μmol/L oleic acid and 500 μmol/L oleic acid + palmitic acid (volume ratio 2∶1) treated for 24 h could significantly increase the intracellular lipid accumulation (< 0.001) without affecting the cell activity, which proves that the modeling is successful. Palmitic acid modeling alone caused great damage to both kinds of cells, so the model was not suitable for the discovery and evaluation of lipid-lowering substances. After modeling with 500 μmol/L oleic acid and 500 μmol/L oleic acid + palmitic acid, expressions of de novo lipogenesis synthesis related proteins sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1), acetyl-CoA carboxylase (ACC) and fatty acid synthase (FASN) were not significantly increased, but the expression of lipolysis related protein adipose triglyceride lipase (ATGL) was significantly increased (< 0.05, 0.001), and phosphorylation of hormone sensitive lipase (HSL) was significantly decreased (< 0.05, 0.01), and the expression of peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα), a protein related to fatty acid oxidation, had no significant difference, while the expression of carnitine palmitoyl transferase 1A (CPT1A) was significantly increased (< 0.05).500 μmol/L oleic acid and 500 μmol/L oleic acid + palmitic acid (volume ratio of 2∶1) can significantly increase the lipid accumulation in HepG2 and AML12 cells, and successfully construct the cell model of NAFLD, which is stable, economical and efficient.

liver lipid metabolism;model; non-alcoholic fatty liver disease; free fatty acid; oleic acid; palmitic acid

R285.5

A

0253 - 2670(2023)10 - 3158 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.013

2023-02-07

國家重點研發計劃項目（2022YFC3502100）；國家自然科學基金面上項目（82274197）；國家自然科學基金面上項目（81773997）；濟南市科研帶頭人工作室項目（202228099）

李建超，碩士研究生，研究方向為中藥藥理學與毒理學。E-mail: lijianchao0117@163.com

孫 蓉，博士生導師，教授，從事中藥藥理學與毒理學研究。E-mail: sunrong107@163.com

[責任編輯 李亞楠]