從甜味受體的角度探討玉竹治療陰虛證“補而不膩”作用機制

歐陽征海，吳 璐，李 婷，鄧碧蓮，肖 音，楊華生

從甜味受體的角度探討玉竹治療陰虛證“補而不膩”作用機制

歐陽征海，吳 璐，李 婷，鄧碧蓮，肖 音，楊華生*

江西中醫藥大學，江西 南昌 330004

從甜味受體的角度闡明玉竹治療陰虛證“補而不膩”作用機制。基于甜味受體，確定補陰藥的“滋補”作用是對陰虛指標的逆轉，而逆轉過度即為“滋膩”；采用熱性中藥制備陰虛模型，模型成功后隨機分為模型組、多糖組、醇提取物組和總提取物組，另取未造模大鼠為正常組，測定體質量、體溫、攝食量、攝水量、糞便含水率、皮膚含水率、胃排空率、小腸推進率、胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）、膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）、胃動素（motilin，MTL）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶、水通道蛋白（aquaporin，AQP）、味覺受體第一家族成員（taste receptor family 1 member，T1R）、α-味導素（α-gustducin）等陰虛指標“量”的變化，并采用細胞模型進一步探索上述指標的變化規律。玉竹多糖對攝水量、胃排空率、小腸推進率、GLP-1、MTL、Ca2+, Mg2+-ATP酶、AQP3、T1R3等17個指標有明顯的“逆轉”作用（＜0.05），醇提取物則“順應”陰虛動物攝水量、GLP-1、MTL、Ca2+, Mg2+-ATP酶、AQP3、T1R3等陰虛指標的變化規律（＜0.05）；與多糖比較，玉竹總提取物對陰虛動物的胃排空率、小腸推進率、GLP-1、Na+, K+-ATP酶、AQP1、AQP3、T1R3等陰虛指標有明顯“回調”作用（＜0.05），同時總提取物對細胞中GLP-1、AQP3、T1R2也有明顯“回調”作用（＜0.05）。玉竹基于含有的成分對甜味受體及其相關指標施加“相反”作用，故玉竹總體上呈現“補而不膩”的作用特點。

玉竹；多糖；補而不膩；甜味受體；陰虛；胰高血糖素樣肽-1

中醫認為，具有靜止、凝聚、寒冷、抑制等特性的事物和現象，都屬于陰[1]，故“陰液（水）”屬陰，而“熱”則具有與“陰”相對的特性。因此，陰虛證具有“陰液虧少，陽亢內熱”的臨床表現。研究表明，“陰液虧少”與水通道蛋白（aquaporin，AQP）有關，而“陽亢內熱”則與Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶有密切聯系[2]。“虛則補之”，治療陰虛證自然使用補陰藥。補陰藥不僅可使陰虛動物的AQP表達，以及Na+, K+-ATP酶的活性發生逆轉，還能使陰虛動物的體質量、體溫、攝食量、攝水量、皮膚含水量、糞便含水量也發生逆轉[3]。一定程度上說，這就是補陰藥的“滋補”效應。需要指出的是，補陰藥在發揮“滋補”效應的同時，還具有“滋膩”作用。

然而，典型補陰藥玉竹的功效卻呈現“補而不膩”的特點。玉竹為百合科黃精屬植物玉竹(Mill.) Druce的干燥根莖，其發揮藥效的形式主要有玉竹多糖、玉竹醇提取物、玉竹總提取物3種[4]，其中玉竹醇提取物主要含有總黃酮[5]、總皂苷等[6]。玉竹“補而不膩”的特點，古籍及教材均有相關描述。《本草便讀》云：“……而養陰之藥，又易礙邪，唯玉竹甘平滋潤，雖補而不礙邪……”；《中藥學》在玉竹“性能特點”項下對玉竹的作用特點描述為：“本品……養肺胃之陰而不滋膩……”[7]。然而，玉竹“補而不膩”的深層作用機制目前尚不清楚。玉竹微寒，味甘，甘能補。甘味，也稱甜味，研究表明，表達于味蕾細胞的甜味受體介導“甘（甜）味”的形成與傳遞。甜味受體屬于味覺受體第一家族成員（taste receptor family 1 member，T1R），T1R由T1R1、T1R2、T1R3構成，T1R2和T1R3以二聚體的形式構成甜味受體；甜味物質與T1R2/T1R3結合后，α-味導素（α-gustducin）活化，再經過一系列過程，最終導致膜去極化和神經遞質釋放，傳遞甜味[8]。近年研究還發現，甜味受體在腸道也有表達，激活腸道甜味受體可促進胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）的分泌[9]。GLP-1是一種胃腸激素，能促進胰島素分泌降低血糖，進而調節細胞內、外滲透壓，調控機體“水液”分布。因此，甜味受體與“滋補”作用有關聯；同時，GLP-1還具有延遲胃排空、抑制胃竇運動等作用[10]。因此，甜味受體與“滋膩”也有聯系。

可見，GLP-1既“滋補”，又“滋膩”，GLP-1含量適中，發揮“滋補”作用，含量太高，出現“滋膩”現象，這可能是特殊的“量效關系”。GLP-1是激活甜味受體的主要效應，故可從甜味受體的角度探討玉竹治療陰虛證“補而不膩”作用機制。同時，研究表明，甜味受體還與AQP[11]、Na+, K+-ATP酶[12]以及胃動素（motilin，MTL）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）、膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）等胃腸激素也有聯系[13]。因此，本研究基于補陰藥的作用及GLP-1的“量效關系”，首先將補陰藥對陰虛動物體質量、體溫、攝食量、攝水量、糞便/皮膚含水率、胃排空率、小腸推進率以及Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶、GLP-1、CCK、MTL、VIP、AQP、T1R2、T1R3、α-gustducin等陰虛證指標的“逆轉”作用，確定為“滋補”作用，而“逆轉”超過一定程度，確定為“滋膩”作用；然后采用熱性中藥制備陰虛證模型，研究玉竹多糖、醇提取物、總提取物對上述陰虛指標的影響；在此基礎上，以人十二指腸腺癌HuTu-80細胞為細胞模型進一步驗證玉竹各成分/部位對上述指標的作用。

1 材料

1.1 動物與細胞

SPF級SD雄性大鼠，體質量180～220 g，由江西中醫藥大學動物實驗科技中心提供，許可證號SYXK（贛）2020-0003。大鼠飼養于12 h光照/12 h黑暗交替的環境中，室溫20～25 ℃，相對濕度為40%～60%，自由飲水與進食。動物實驗經江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號JZSYDWLL-20201215）。

HuTu-80細胞購自上海富衡生物科技有限公司。

1.2 藥材

玉竹購自安徽道源堂中藥飲片有限公司，附子、肉桂、干姜購自江西吁江生態科技有限公司，經江西中醫藥大學付小梅教授鑒定分別為百合科植物玉竹(Mill.) Druce的干燥根莖、毛茛科植物烏頭Debx.的子根、樟科植物肉桂Presl的干燥樹皮以及姜科植物姜Rosc的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

GLP-1、MTL、CCK、VIP試劑盒（批號20201019）購自上海恒遠生物科技有限公司；RNA提取試劑盒（批號R1200）購自北京索萊寶科技有限公司；M5 Sprint qPCR RT kit with gDNA remover（批號MF949-01）、Realtime PCR Super mix SYBR green with anti-Taq（批號MF013-01）購自北京聚合美生物科技有限公司；Na+, K+-ATP酶試劑盒（批號A070-2-2）、Ca2+, Mg2+-ATP酶試劑盒（批號A070-3-2）購自南京建成生物工程研究所；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；AQP1抗體（批號ET1703-34）、AQP3抗體（批號HA500247）、β-actin抗體（批號EM21002）、二抗（批號HA1006）購自杭州華安生物技術有限公司；T1R2抗體（批號Ab-DF10279）購自Affinity Biosciences公司；T1R3抗體（批號A10157）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；α-gustducin抗體（批號bs-6149R）購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.4 儀器

Multiskan GO全波長酶標儀（美國Thermo公司）；Light Cycler 96型qRT-PCR儀（羅氏集團）；Chemidoc XRS+高靈敏度化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）；752型紫外-可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；MC-347型歐姆龍電子體溫計（歐姆龍大連有限公司）；Allegra 64R型高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；DYCZ-24DN型雙垂直電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 藥物的制備

取玉竹，加水浸泡1.0 h后，加熱至100 ℃，回流提取2次，同時收集揮發油，備用（得率0.98%）；合并提取液，濃縮，加乙醇至含醇80%，冷藏，過濾，沉淀干燥，即得玉竹“多糖”，質量分數為73.25%，得率21.19%，且符合《中國藥典》2020年版要求[14]；濾液濃縮，干燥，粉碎，與上述揮發油混合均勻，即得玉竹“醇提取物”，得率12.30%，其中含總黃酮2.93%、總皂苷6.50%；合并玉竹“多糖”與玉竹“醇提取物”，即得玉竹“總提取物”。

取附子適量，加水100 ℃提取60 min后，再加入干姜、肉桂提取，濾過，藥渣再提取1次，合并2次濾液，濃縮至生藥質量濃度2 g/mL，即得“熱性中藥”提取液，4 ℃儲存，備用。

2.2 基于整體動物模型闡釋玉竹“補而不膩”機制

2.2.1 動物造模、分組及給藥 取大鼠50只，ig熱性中藥（10 mL/kg）制備陰虛證模型，以體質量、活動狀態、毛發光澤、爪色、尿液顏色、糞便質地為模型評價指標[15]。造模成功后隨機分為模型組、多糖（267 mg/kg，根據臨床劑量及浸膏得率換算，下同）組、醇提取物（155 mg/kg）組和總提取物組（422 mg/kg）組，每組10只；另取10只大鼠作為正常組，正常組及模型組ig等體積的0.9%生理鹽水，1次/d，連續28 d。

2.2.2 體質量、體溫、攝食量、攝水量、糞便含水率、皮膚含水率的檢測 參照文獻方法[16]，分別于給藥前及給藥后7、14、21、28 d進行體質量、體溫、攝食量、攝水量測定。同天收集大鼠24 h的糞便，稱定，記為濕質量，然后在90 ℃的烘箱中烘干3 h，稱定，記為干質量，計算糞便含水率[17]；取皮膚約1 cm2，稱定質量，記為濕質量，隨即放入80 ℃烘箱中干燥2 h，稱定質量，記為干質量，計算皮膚含水率[18]。

糞便含水率＝(濕質量－干質量)/濕質量

皮膚含水率＝(濕質量－干質量)/濕質量

2.2.3 胃排空率與小腸推進率的測定 末次給藥后，禁食不禁水12 h，ig酚紅溶液，30 min后ip戊巴比妥鈉麻醉，取胃并切開，以蒸餾水沖出內容物并收集，定容，加NaOH溶液混勻，室溫放置后取上清液加入20%三氯乙酸溶液，離心后取上清液測定其吸光度（）值，記為實測酚紅；另取0.04%酚紅-明膠溶液，按上述方法，依次加蒸餾水、NaOH、三氯乙酸溶液，混勻配成標準溶液，測定值，記為標準酚紅，計算胃排空率[19]。同時分離小腸，直鋪于冰上，量取小腸全長及酚紅在小腸內的推進的距離，計算小腸推進率[20]。

胃排空率＝1－實測酚紅/標準酚紅

小腸推進率＝幽門至酚紅染成紅色末端的距離/幽門至回盲瓣的距離

2.2.4 取樣 在完成“2.2.3”項下實驗后，取皮膚、肺、肝、胃、腎、十二指腸，放入?80 ℃超低溫冰箱，備用；另腹主動脈取血，靜置，離心，取上清，得血清，備用，同時收集下層紅細胞，備用。

2.2.5 GLP-1、CCK、MTL、VIP含量的測定 取血清，按試劑盒說明書，采用ELISA法測定血清中GLP-1、CCK、MTL、VIP的含量。

2.2.6 Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性測定 取肝、腎組織適量，按1∶9加生理鹽水，勻漿，4 ℃離心，取上清測定酶的活性；取紅細胞于離心管，加PBS及PMSF，置冰上破溶，離心，得紅細胞膜，備用；取細胞膜，加裂解液，反復凍融3次，離心，取上清測定酶的活性。

2.2.7 qRT-PCR測定、、、和mRNA表達 取肺、胃、腎、十二指腸適量，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.2.8 Western blotting測定AQP1、AQP3、T1R2、T1R3和α-gustducin蛋白表達 取肺、胃、腎、十二指腸適量，勻漿，加裂解液提取蛋白，測定蛋白濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉，加入一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗孵育，洗滌，顯色。

2.3 基于細胞模型闡釋玉竹“補而不膩”機制

2.3.1 Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性測定 取對數生長期的HuTu-80細胞，以4×105個/孔接種于6孔板，貼壁后吸去培養基，設置正常組、多糖（200 μg/mL）組、醇提取物（100 μg/mL）組和總提取物（300 μg/mL）組，正常組加入細胞培養液2 mL，給藥組加入同體積的相應提取液，繼續培養24 h后，消化后離心收集細胞，加緩沖液，勻漿破碎細胞，測定Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶的活性。

2.3.2 GLP-1含量的測定 按“2.3.1”項下進行分組和給藥，培養24 h后吸去培養基，再加入3 mmol/L葡萄糖，孵育5 min，小心吸取細胞培養液于EP管內，4 ℃離心10 min，取上清測定GLP-1含量。

2.3.3 qRT-PCR和Western blotting測定、、、mRNA和蛋白表達 按“2.3.1”項下進行分組和給藥，培養24 h后吸去培養基，按“2.2.7”項下方法測定細胞中、、、mRNA表達，按“2.2.8”項下方法測定細胞中AQP1、AQP3、T1R2、T1R3蛋白表達。

2.4 統計學分析

3 結果

3.1 玉竹對陰虛大鼠體質量、體溫、攝食量、攝水量、糞便含水率和皮膚含水率的影響

如圖1-A所示，“陰虛”會導致大鼠體質量下降（＜0.05）；與模型組比較，給予玉竹多糖、總提取物干預14 d后，大鼠體質量明顯增加（＜0.05），而“陰虛”動物的體溫并未見明顯升高（圖1-B）。如圖1-C所示，“陰虛”會導致動物的攝水量增加（＜0.05），而玉竹醇溶性成分則“順應”這種規律，給予醇提取物干預7、14 d，大鼠的攝水量進一步增加（＜0.05），這可能與醇溶性提取物中含有揮發油有關[21]；然而給予玉竹多糖14 d后，攝水量顯著下降（＜0.05）。如圖1-D所示，多糖組大鼠在給藥前期（7、14 d）攝食量顯著上升（＜0.05），而給藥21 d后呈下降趨勢，給藥28 d攝食量明顯下降（＜0.05）；這一結果表明，玉竹多糖可能對陰虛動物具有“治療”作用而出現攝食量增加，但久服多糖可能出現了“滋膩礙胃”效應，降低了大鼠的食欲而致攝食量下降。如圖1-E所示，與模型組比較，給予玉竹多糖、總提取物組21 d后，大鼠糞便含水率明顯上升（＜0.05）；如圖1-F所示，與模型組比較，多糖組、總提取物組大鼠皮膚含水率顯著升高（＜0.05）。

與正常組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05；與多糖組比較：△P＜0.05，下圖同

3.2 玉竹對陰虛大鼠胃排空率、小腸推進率和胃腸激素的影響

如圖2-A所示，與正常組比較，模型組大鼠胃排空率、小腸推進率顯著上升（＜0.05）；與模型組比較，多糖組大鼠胃排空率和小腸推進率明顯減慢（＜0.05）；與多糖組比較，總提取物組大鼠胃排空率和小腸推進率顯著增加（＜0.05）。如圖2-B所示，與正常組比較，模型組大鼠血清中GLP-1、CCK和VIP含量明顯降低（＜0.05），MTL含量顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，多糖組大鼠GLP-1、CCK和VIP含量明顯上升（＜0.05），MTL含量顯著下降（＜0.05）；醇提取物組大鼠GLP-1含量進一步降低（＜0.05），MTL含量卻進一步明顯升高（＜0.05）；與多糖組比較，總提取物組大鼠GLP-1含量明顯下降（＜0.05）。

3.3 玉竹對陰虛大鼠肝、腎、紅細胞膜中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性的影響

如圖3-A所示，與正常組比較，模型組大鼠肝、腎組織中Na+, K+-ATP酶活性明顯上升（＜0.05）；與模型組比較，多糖組、總提取物組大鼠肝、腎組織中Na+, K+-ATP酶明顯下降（＜0.05）；與多糖組比較，總提取物組大鼠肝組織中Na+, K+-ATP酶明顯上升（＜0.05）。如圖3-B所示，與正常組比較，模型組大鼠肝、腎、紅細胞膜中Ca2+, Mg2+-ATP酶活性明顯上升（＜0.05）；與模型組比較，多糖組肝組織中Ca2+, Mg2+-ATP酶活力明顯下降（＜0.05），而醇提取物組大鼠肝、腎、紅細胞膜中Ca2+, Mg2+-ATP酶活性進一步上升（＜0.05）。

圖2 玉竹對陰虛大鼠胃排空率、小腸推進率(A) 及胃腸激素水平(B) 的影響(, n = 10)

圖3 玉竹對陰虛大鼠肝、腎、紅細胞膜中Na+, K+-ATP酶(A)和Ca2+, Mg2+-ATP酶 (B) 活性的影響(, n = 10)

3.4 玉竹對陰虛大鼠肺、胃、腎組織中AQP1、AQP3 mRNA和蛋白表達的影響

如圖4-A、D所示，與正常組比較，模型組大鼠肺、胃、腎中、mRNA表達水平均顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，多糖組肺、腎中、mRNA表達水平明顯上升（＜0.05），醇提取物組胃mRNA表達水平卻顯著下降（＜0.05）；與多糖組比較，總提取物組大鼠肺、胃中mRNA表達水平顯著下降（＜0.05）。如圖4-B、C、E、F所示，與模型組比較，多糖組肺、胃、腎AQP1、AQP3蛋白表達水平均明顯上升（＜0.05），總提取物組腎AQP1、AQP3蛋白表達水平明顯上升（＜0.05）；與多糖組比較，總提取物組肺、胃中AQP1、AQP3蛋白表達水平明顯下降（＜0.05）。

3.5 玉竹對陰虛大鼠十二指腸組織中T1R2、T1R3、α-gustducin mRNA和蛋白表達的影響

如圖5-A所示，與正常組比較，模型組大鼠、和mRNA表達均顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，多糖組大鼠、、mRNA表達均明顯升高（＜0.05），而醇提取物組mRNA的表達則“順應”陰虛動物的變化規律，表達進一步下降（＜0.05）；與多糖組比較，總提取物組mRNA表達明顯下降（＜0.05）。如圖5-B、C所示，與正常組比較，模型組T1R2、T1R3、α-gustducin蛋白表達顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，多糖組T1R2、T1R3、α-gustducin蛋白表達明顯升高（＜0.05），醇提取物組T1R3表達進一步下降（＜0.05）；與多糖組比較，總提取物組T1R3蛋白表達明顯下降（＜0.05）。

圖4 玉竹對陰虛大鼠肺、胃、腎組織中AQP1、AQP3 mRNA (A、D) 和蛋白(B、C、E、F) 表達的影響(, n = 6)

圖5 玉竹對陰虛大鼠十二指腸組織中T1R2、T1R3、α-gustducin mRNA (A) 和蛋白(B、C) 表達的影響(, n = 6)

3.6 玉竹對HuTu-80細胞中Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶、GLP-1、AQP1、AQP3、T1R2、T1R3的影響

如圖6-A所示，與正常組比較，多糖組Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性明顯下降（＜0.05）。圖6-B顯示，多糖可明顯促進GLP-1的分泌（＜0.05），而醇提取物則可顯著抑制GLP-1分泌（＜0.05）；與多糖組比較，總提取物組GLP-1含量明顯下降（＜0.05）。如圖6-C所示，與正常組比較，多糖組、、mRNA表達水平明顯上升（＜0.05），而醇提取物組、mRNA表達水平明顯降低（＜0.05）；與多糖組比較，總提取物組mRNA表達水平明顯降低（＜0.05）。如圖6-D、E所示，與正常組比較，多糖組AQP1、T1R2蛋白表達水平明顯升高（＜0.05），醇提取物組T1R2、T1R3蛋白表達水平則明顯下降（＜0.05）；與多糖組比較，總提取物組T1R2蛋白表達水平明顯降低（＜0.05）。

圖6 玉竹對HuTu-80細胞中Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性(A)、GLP-1含量 (B)、AQP1、AQP3、T1R2、T1R3 mRNA (C) 及蛋白(D、E)表達的影響(, n = 6)

4 討論

補陰藥味“甘”，既具“滋補”之效，又有“滋膩”之弊，正如《醫學源流論》所云：“補益滋膩之藥”。《中醫診斷學》認為，陰虛證是指人體陰液虧少，其滋潤、濡養功能減退，或陰不制陽，陽氣偏亢，以口咽干燥、五心煩熱、潮熱盜汗為主要表現的虛熱證[22]。因此，補陰的“滋補”效應可看作是補陰藥對陰液虧少、潮熱盜汗等“癥狀”的緩解作用。本研究將“陰虛”動物的體質量、體溫、攝食量、攝水量、糞便含水率、皮膚含水率、胃排空率、小腸推進率、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶、GLP-1、CCK、MTL、VIP、AQP1、AQP3、T1R2、T1R3、α-gustducin作為“陰虛指標”。在這些指標中，體質量等15個指標與陰虛均有直接聯系[3,23-24]，而GLP-1、T1R2、T1R3、α-gustducin 4個指標與陰虛的直接關聯，還有待進一步挖掘；但研究發現GLP-1、T1R2、T1R3、α-gustducin等指標與糖尿病有關聯[9,25]，而糖尿病常有“陰虛”表現。在確定“陰虛指標”的基礎上，將補陰藥對陰虛模型動物陰虛指標的“逆轉”作用確定為“滋補”作用，如“逆轉”超出一定程度，即為“滋膩”作用。因此，“滋膩”不只是與胃腸蠕動減慢有關，還與其他因素有關，如AQP蛋白的表達超出一定范圍，水濕停滯，也易“滋膩”。

動物模型的合理性、可重復性是中醫藥研究科學性、可靠性的重要保障。目前“陰虛證”動物模型的構建主要包括“模擬陰虛證臨床表現、模擬陰虛證病因病機、模擬陰虛臨床高發病”3種方法[26]。采用甲狀腺素激素構建陰虛證即屬于“模擬陰虛證臨床表現”的造模方法，而采用四氯化碳導致肝炎進而出現“陰虛”，即屬于“模擬陰虛臨床高發病”的造模方法。本研究采用熱性中藥制備陰虛模型，屬于“模擬陰虛證病因病機”的造模方法。《素問·陰陽應象大論》云：“陽盛則陰病”，且玉竹是典型的補陰藥，主要用于胃陰虛、肺陰虛，因此ig熱性中藥，易導致“胃陰虛”。實驗中發現，大鼠長期ig熱性中藥后“陰虛”癥狀明顯，無死亡現象，重復性較好。需要指出的是，ig熱性中藥可能是“實熱”，也可能是“陰虛（內熱）”。本研究發現，造模前期，大鼠出現煩躁、易怒等“實熱”癥狀，但“久服”熱性中藥后，大鼠攝水量增加，皮膚干燥，而體溫卻未見明顯變化，表明出現了“陰虛（內熱）”。

甜味受體分布廣泛，激動腸道甜味受體可促進腸道L細胞分泌GLP-1。GLP-1不僅可促進胰島素分泌，還能抑制食欲減緩胃排空[27]。因此，GLP-1體現了“滋補”、“滋膩”2種相反效應。本研究中，陰虛大鼠GLP-1的分泌下降，胃腸道蠕動能力增強，這也與胃排空與小腸推進率實驗結果一致；給予玉竹多糖干預后，GLP-1分泌明顯增加，而與多糖組比較，總提取物組大鼠GLP-1明顯下降。從GLP-1的效應分析，服用玉竹多糖后GLP-1的分泌量明顯增加，在發揮“滋補”作用的同時，也必然出現胃腸蠕動減慢等“滋膩”效應；服用由多糖、醇提取物組成的玉竹總提取物，其中的多糖促進GLP-1的分泌，而其中的醇提取物則抑制GLP-1的分泌。這可能是玉竹治療陰虛證“補而不膩”的主要機制。同時，本研究還發現，陰虛會導致T1R2、T1R3的表達降低，玉竹多糖、玉竹醇提取物對T1R2、T1R3的表達均有作用，但作用相反；在細胞實驗中T1R2、T1R3的表達也有相似的規律。可見，玉竹醇提取物可部分抵消玉竹多糖對甜味受體表達的作用，這可能是玉竹“補而不膩”主要物質基礎。

課題組前期研究玉竹多糖對糖尿病大鼠甜味受體的影響，結果顯示，玉竹多糖對甜味受體T1R2、T1R3的表達有促進作用[28]；結合本實驗結果推測，玉竹多糖可能通過上調甜味受體的表達，并在內源性甜味劑——葡萄糖的參與下，促進GLP-1的分泌；換句話說，玉竹多糖可能是甜味受體的誘導劑，而非激動劑，因此本實驗未考察玉竹多糖與甜味受體激動劑/抑制劑合用后的效應；與玉竹多糖不同，玉竹醇提取物中含有的物質可能是甜味受體抑制劑，能下調甜味受體的表達；還可能既是抑制劑又是拮抗劑，在下調甜味受體表達的同時還能阻斷激動劑與之結合。課題組已從玉竹醇提取物中分離純化了“玉竹皂苷”（質量分數為63.5%），并考察了玉竹皂苷單用及與甜味受體抑制劑Lactisole合用時對GLP-1分泌的影響；接下來，將進一步研究“玉竹醇提取物”中另一種成分——玉竹黃酮對甜味受體及GLP-1的作用。

研究表明，甜味受體與AQP、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶存在關聯，AQP的功能主要是是介導水的轉運[29]。研究發現，皮膚中的AQP3表達與陰虛皮膚干燥存在一定聯系[30]；本實驗中，陰虛大鼠肺、胃、腎中AQP1、AQP3表達降低，給予多糖后，AQP1、AQP3表達升高，而給予醇提取物后，胃、腎AQP3的表達在模型組的基礎上進一步降低；細胞實驗中的玉竹多糖、醇提取物對AQP1、AQP3表達也呈現與整體動物相似的規律。研究還發現，甲狀腺功能亢進、糖尿病等“陰虛”證Ca2+, Mg2+-ATP酶的活性也會發生相應改變[31]。本研究中，與模型組比較，多糖組大鼠肝Ca2+, Mg2+-ATP酶活力明顯下降，醇提取物組大鼠肝、腎、紅細胞膜Ca2+, Mg2+-ATP酶活力明顯上升。本實驗結果表明，玉竹多糖與玉竹醇溶性成分對Ca2+, Mg2+-ATP酶活力的影響也可能存在“相反”效應，即玉竹醇溶性成分可在一定程度上“抵消”了玉竹多糖對Ca2+, Mg2+-ATP酶活性的“抑制效應”。以上研究表明，玉竹多糖、玉竹醇溶性成分對AQP、Ca2+, Mg2+-ATP酶的作用的方向“相反”，這可能也是玉竹“補而不膩”的機制之一。

進一步分析發現，玉竹對GLP-1、T1R2、T1R3、AQP、Ca2+, Mg2+-ATP酶等陰虛指標具有“雙向調節”作用；事實上，玉竹“既能滋陰又能增長陽氣”[32]，這就是玉竹的“雙向調節”作用的中醫表述。雙向調節是指當機體處于失衡狀態時，采用同一藥物或方劑治療后，既能使機體從亢進狀態向正常狀態轉化，亦可使機體從低下狀態向正常狀態轉化[33]。需要注意的是，機體從“失衡狀態”到“正常狀態”的轉變，也可能是基于機體的“自然恢復性”。本文結果表明，模型組與給藥組的陰虛指標在“數值”上存在較大的差別。因此推斷，玉竹對GLP-1、T1R2、T1R3、AQP、Ca2+, Mg2+-ATP酶等陰虛指標具有“雙向調節”作用，其機制可能與玉竹同時含有多糖、醇提取物等“多成分”有關。

綜上，玉竹多糖通過上調甜味受體的表達，促進GLP-1分泌，“逆轉”了AQP、Na+, K+-ATP酶等陰虛指標，從而發揮“滋補-滋膩”正反效應，而醇提取物則部分抵消多糖對GLP-1、T1R2、T1R3、AQP、Ca2+, Mg2+-ATP酶等指標的逆轉效應，故玉竹總體上呈現“補而不膩”。由于目前尚無公認的用于治療陰虛證的藥物，且基于“甜味受體”治療陰虛證的藥物缺乏，本研究未設置陽性對照組。本研究從“成分”出發，分析比較玉竹中各成分對“陰虛指標”的作用方向及作用強度，從“甜味受體”一個角度，同時闡明玉竹“滋補-滋膩-不膩”，即“補而不膩”的作用機制，為玉竹、補陰藥、甘味藥的功效闡釋提供新思路，豐富并助推了五味理論的傳承與發展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of “tonifying but not cloying” effect ofin treatment ofdeficiency from perspective of sweet taste receptors

OU YANG-zheng hai, WU Lu, LI Ting, DENG Bi-lian, XIAO Yin, YANG Hua-sheng

Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

To elucidate the mechanism of “tonifying but not cloying” effect ofin treatment ofdeficiency from the perspective of sweet taste receptors.Based on sweet taste receptors, it was determined that the “tonifying” effect oftonics was a reversal ofdeficiency indicators, and that excessive reversal was “cloying”. The model ofdeficiency was prepared by using hot Chinese medicine, and was randomly divided into model group, polysaccharide group, alcoholic extract group and total extract group after the model was successful, the unmodeled rats were also taken as the normal group. “Quantitative” changes ofdeficiency indicators such as body weight, body temperature, food intake, water intake, fecal water content, skin water content, gastric emptying rate, small intestine propulsion rate, glucagon-like peptide-1 (GLP-1), cholecystokinin (CCK), motilin (MTL), vasoactive intestinal peptide (VIP), Na+, K+-ATPase, Ca2+, Mg2+-ATPase, aquaporin (AQP), taste receptor family 1 member (T1R), α-gustducin were measured. And the cellular model was used to further explore the change pattern of the above indexes.Polysaccharide had a significant “reversal” effect on 17 indicators including water uptake, gastric emptying rate, small intestine propulsion rate, GLP-1, MTL, Ca2+, Mg2+-ATPase, AQP3 and T1R3 (< 0.05), alcoholic extract “conformed” to the pattern of changes indeficiency indicators such as water intake, GLP-1, MTL, Ca2+, Mg2+-ATPase, AQP3 and T1R3 indeficient animals (< 0.05). Compared with polysaccharides, total extract had a significant “back-regulating” effect on gastric emptying rate, small intestine propulsion rate, GLP-1, Na+, K+-ATPase, AQP1, AQP3, T1R3 and otherdeficiency indexes indeficient animals (< 0.05), while total extract also had a significant “back-regulating” effect on cellular GLP-1, AQP3, T1R2 (< 0.05). Total extract also had a significant “back-regulating” effect on GLP-1, AQP3 and T1R2 in cells (< 0.05).The overall effect ofis “tonifying but not cloying” because of its components that exert “opposite” effects on sweet taste receptors and their related indicators.

(Mill.) Druce; polysaccharide; tonifying but not cloying; sweet taste receptor;deficiency; glucagon-like peptide-1

R285.5

A

0253 - 2670(2023)10 - 3179 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.015

2022-11-28

國家自然科學基金資助項目（81960724）；校級研究生創新專項（JZYC22S66）

歐陽征海（1997—），男，碩士研究生。E-mail: 1174118351@qq.com

楊華生（1974—），男，博士，教授，研究方向為中藥制劑及傳統中藥理論。E-mail: 652477071@qq.com

[責任編輯 李亞楠]