基于抗肝纖維化生物活性及近紅外譜效相關的鱉甲質量評價研究

曹夢珍，黃 倩，牛 明，趙 旭*，肖小河*

? 藥理與臨床 ?

基于抗肝纖維化生物活性及近紅外譜效相關的鱉甲質量評價研究

曹夢珍1, 2，黃 倩2，牛 明2，趙 旭2*，肖小河1, 2*

1. 成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 610032 2. 中國人民解放軍總醫院 第五醫學中心 肝病醫學部研究所，北京 100039

從鱉甲臨床抗肝纖維化功效出發并結合近紅外光譜，探索建立關聯抗肝纖維化活性的鱉甲質量生物活性評價方法。建立轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導的LX-2肝纖維化細胞模型，采用qRT-PCR檢測鱉甲對I型膠原（type I collagen，）mRNA表達的影響，計算鱉甲對mRNA相對表達量的抑制率；采用Western blotting檢測鱉甲對COL1蛋白表達的影響，以評價鱉甲在細胞模型上的抗肝纖維化生物活性。采集并處理不同批次鱉甲藥材的近紅外光譜數據，通過譜-效相關分析探究鱉甲藥材近紅外光譜數據與其抗肝纖維化活性的相關性，篩選活性波段，建立鱉甲的效應近紅外譜，以效應近紅外譜下面積評價鱉甲藥材的質量。體外實驗表明，與模型組比較，鱉甲水提物（water extract of，WECT）處理組細胞中mRNA與蛋白表達水平顯著下調（＜0.05、0.01）；基于譜-效相關分析，共篩選得到＞0.6、＜0.05且波數大于8 cm?1的活性波段3個，分別為5226～5235 cm?1、5943～6071 cm?1與6379～6396 cm?1，以3個活性波段下面積為指標，建立鱉甲藥材的效應近紅外譜，計算各特征波段下面積和，并分析其與生物活性的相關性，兩者相關系數為0.813 53。WECT可抑制LX-2細胞外基質的產生來治療肝纖維化；效應波譜下面積和（5226～5235 cm?1、5943～6071 cm?1與6379～6396 cm?1）作為鱉甲藥材的質量評價系數，用于評價鱉甲藥材的質量，可區分不同批次鱉甲藥材的抗肝纖維化活性。

鱉甲；肝纖維化；質量評價；生物評價；近紅外光譜；譜效相關分析

鱉甲來源于鱉科動物鱉Wiegmann的背甲，始載于《神農本草經》，在我國已有上千年的使用歷史，中醫認為其具有滋陰潛陽、退熱除蒸、軟堅散結等功效，臨床用于治療陰虛發熱、勞熱骨蒸、虛風內動、經閉、癥瘕等癥[1-2]。既往系統生物學研究顯示，鱉甲提取物具有抗纖維化、抗氧化及抗腫瘤等藥理作用[2]。臨床研究也證實，以鱉甲為君藥組方的鱉甲軟肝片、鱉甲化纖方及鱉甲煎丸等復方中藥具有顯著減緩或逆轉肝纖維化的臨床療效[3-7]，可見鱉甲在肝纖維化治療領域具有廣闊前景。但目前，鱉甲的成分物質基礎，尤其是其發揮抗肝纖維化作用的藥效物質基礎研究幾乎為空白[3]，同時，由于鱉甲為動物藥，傳統的基于成分的質量評價方法難以對其進行準確客觀地判斷，這進一步造成了其質量難以保證等問題。由于中藥質量的一致性是保障其臨床療效穩定性的重要因素，因此，有必要開發質量控制手段保障其在臨床抗肝纖維化治療領域發揮更大作用。

近紅外光譜技術作為一種新興的檢測技術，已廣泛應用于食品、藥品等多個行業領域。本課題組前期構建了中藥效應近紅外譜、整合近紅外光譜法以及生物評價2種評價方法，并以大黃配方顆粒為例表明與大黃配方顆粒瀉下活性高度相關的5個活性特征波段（4011～4390 cm?1、4859～5461 cm?1、7012～7493 cm?1、10 992～11 312 cm?1以及11 871～12 489 cm?1）能夠有效地將不同廠家不同批次的配方顆粒區分開，可實現大黃配方顆粒質量波動的快速、在線檢測[8]。另有研究顯示，采用近紅外光譜技術可快速準確地識別豬皮膠、牛皮膠、驢皮膠3種阿膠產品[9]；采用近紅外光譜分析技術建立的干姜中多指標成分含量快速預測方法，可對不同產地干姜進行快速無損的質量評價[10]。以上研究表明近紅外光譜分析技術可將不同藥材或同一藥材的不同批次較好地區分，對于中藥材的質量控制具有可觀的應用前景。

鱉甲在肝纖維化臨床治療中應用廣泛，肝纖維化作為慢性肝臟疾病的結局，其中心環節是肝細胞損傷引起的肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活[11]，正常情況下HSCs處于靜止狀態，產生少量細胞外基質（extracellular matrix，ECM）[12]，而激活的HSCs會產生大量的ECM，從而快速引起膠原化反應[13]。ECM主要由I型膠原（type I collagen，COL1）、IV型膠原等組成，COL1側向排列形成的大量膠原纖維是肝纖維化的典型特征，也是肝纖維化嚴重程度評價的主要指標。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）為肝纖維化模型的活化劑，可使HSC處于高活化狀[5]。因此，對于動物藥鱉甲的質量控制，采用與臨床療效直接關聯的抗肝纖維化生物評價模式，基于譜-效相關建立活性校正的指紋圖譜，對于保障鱉甲的質量，擁有良好的應用遠景。

本研究以鱉甲為模式藥，以“源自臨床，證于實驗”為研究路徑，從鱉甲的臨床作用出發，基于TGF-β1誘導的人HSC細胞系LX-2肝纖維化細胞模型，初步探索鱉甲水提物的抗肝纖維化生物活性，為鱉甲的質量控制及鱉甲抗肝纖維化機制研究提供線索；對鱉甲近紅外譜信息與抗肝纖維化生物活性進行相關性分析，建立關聯活性的質量評價模式，以期克服鱉甲質量控制與生物活性關聯不強、代表性不足等問題。

1 材料

1.1 細胞

人肝星狀LX-2細胞由解放軍總醫院第五醫學中心肝病醫學中心提供。

1.2 藥材

鱉甲藥材（具體信息見表1）購自北京安國藥材市場，經解放軍總醫院第五醫學中心肖小河研究員鑒定為鱉科動物鱉Wiegmann的背甲，且按《中國藥典》2020年版要求檢查合格。

表1 18批次鱉甲藥材樣品信息

1.3 藥品與試劑

DMEM培養基（批號CM10013）購自北京中科邁晨生物技術有限公司；青霉素-鏈霉素雙抗（批號CC008）、胰酶（批號CC008）購自邁晨科技（北京）有限公司；CCK-8試劑（批號FC0720）、RT Master Mix for qPCR（批號HY-K0510）、SYBR Green qPCR Master Mix（批號HY-K0521）購自Med Chem Express公司；qRT-PCR引物由上海生工生物工程公司合成；RNA快速純化試劑盒（批號ES-RN001）購自上海奕杉生物科技有限公司；RIPA裂解液（批號C1053）購自北京普利萊基因技術有限公司；BCA法蛋白定量試劑盒（批號C190501）購自北京陽光英銳生物科技有限公司；COL1多克隆抗體（批號72026S）購自美國CST公司；GAPDH多克隆抗體（批號A01020）購自Abbkine公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（批號P21118）、HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗（批號P21206）購自北京全式金生物技術股份有限公司。

1.4 儀器

HF100型CO2恒溫培養箱（上海力申科學儀器有限公司）；SW-CJ-2F/2FD型超凈工作臺（蘇州凈化儀器廠）；IX70型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；MSA36S型分析天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q超純水制備系統（美國Millipore公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲波儀器有限公司）；MPA型傅立葉變換近紅外分析儀（德國Bruker公司）；Fresco 21型超低速低溫離心機、ABI QuantStudio 6 Flex型熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5200Multi型全自動化學發光成像儀（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 提取物的制備 稱取鱉甲藥材，粉粹，過80目篩，料液比1∶20，40 ℃、250 kW超聲水提30 min，減壓濃縮，冷凍干燥，得鱉甲藥材的超聲水提物（water extract of，WECT），備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取上述提取物粉末，按照要求配制成相應濃度，過0.22 μm濾膜，得供試品溶液。

2.2 體外實驗

2.2.1 WECT細胞毒性的測定 將LX-2細胞以2×105個/mL均勻接種于96孔板中，100 μL/孔，細胞貼壁后，分別加入生藥質量濃度為0、25、50、100、150、200、300 mg/mL的WECT處理1 h，隨后加入20 ng/mL TGF-β1共培養24 h，按照CCK-8試劑說明書檢測細胞活力。

2.2.2 qRT-PCR驗證WECT抗肝纖維化生物活性 將LX-2細胞以2×105個/mL均勻接種于24孔板中，500 μL/孔，細胞貼壁后，分別加入生藥質量濃度為40、80、120、160、200、300 mg/mL的WECT處理1 h，隨后加入20 ng/mL TGF-β1共培養24 h，收集細胞，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表2。

表2 引物序列

計算WECT對mRNA相對表達量的抑制率，并計算半數效應濃度（50% effective concentration，EC50）值。隨后在EC50對應的生藥濃度下，考察不同批次WECT對mRNA相對表達的抑制率，評價鱉甲藥材的抗肝纖維化生物活性。

相對表達量抑制率＝(模型組相對表達量－給藥組相對表達量)/模型組相對表達量

2.2.3 Western blotting檢測WECT抗肝纖維化生物活性 將LX-2細胞以2×105個/mL均勻接種于6孔板中，2 mL/孔，細胞貼壁后，分別加入生藥質量濃度為120、160、200、300 mg/mL的WECT處理1 h，隨后加入20 ng/mL TGF-β1共培養24 h，收集細胞，使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，TBST洗膜后加入COL1、GAPDH抗抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜后，加入二抗，室溫孵育1 h，最后用ECL發光液顯影。

2.3 近紅外光譜數據采集及處理

選取10批（S1～S10）鱉甲藥材，用于建立基于效應近紅外譜的鱉甲質量評價方法，其余8批（S11～S18）用于驗證質量評價方法的科學性。取適量WECT，加入去離子水溶解至生藥質量濃度1000 mg/mL，統一裝入1 mL液體樣品測量管，采集光譜。采樣方式：光譜掃描范圍12 500～4000 cm?1，分辨率8 cm?1，以去離子水溶液為空白，掃描32次，每個樣品重復3次，求平均光譜。為了排除干擾因素造成測量結果的偏倚，利用OPUS7.5軟件對近紅外光譜數據進行一階導數預處理，并對經過一階導數預處理的近紅光譜數據進行相似度分析。

2.4 不同批次的鱉甲藥材抗肝纖維化生物活性的評價

在40、60、120、160、200、300 mg/mL生藥質量濃度下測定WECT對肝纖維化模型細胞中mRNA相對表達量的抑制率，并計算EC50值。檢測生藥濃度為EC50時，10個批次WECT對TGF-β1誘導的肝纖維化模型細胞中mRNA表達量的抑制率，評價不同批次鱉甲藥材的抗肝纖維化生物活性。

2.5 統計學分析

3 結果

3.1 體外實驗結果

CCK-8法檢測WECT的細胞毒性，結果顯示WECT在生藥濃度不超過300 mg/mL下處理LX-2細胞24 h無細胞毒性（圖1-A）。肝星狀細胞的活化與增殖是肝纖維化的關鍵，本實驗構建了TGF-β1誘導的LX-2肝纖維化細胞模型，用于評價WECT的抗肝纖維化生物活性。如圖1-B、C所示，與對照組比較，模型組mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，WECT（120、160、200、300 mg/mL）組mRNA表達水平顯著降低（＜0.05、0.01），300 mg/mL WECT可顯著抑制COL1蛋白的表達（＜0.05）。

A-WECT對LX-2細胞存活率的影響 B-WECT對TGF-β1誘導的LX-2細胞COL1 mRNA表達的影響 C-WECT對TGF-β1誘導的LX-2細胞COL1蛋白表達的影響 與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.2 近紅外光譜數據的預處理與相似度分析

10批鱉甲藥材（S1～S10）的近紅外光譜數據見圖2-A，OPUS7.5軟件對近紅外光譜數據進行一階導數預處理見圖2-B。對經過一階導數預處理的近紅光譜數據進行相似度分析（表3），結果顯示10批鱉甲藥材的相似大于0.9，這表明10批鱉甲藥材的近紅外光譜信息的相似度高，提示單以近紅外光譜數據難以實現鱉甲藥材的質量評價。

3.3 不同批次的鱉甲藥材抗肝纖維化生物活性的評價

在40、60、120、160、200、300 mg/mL生藥質量濃度下測定WECT對肝纖維化模型細胞中mRNA相對表達量的抑制率，計算得到EC50值為149.5 mg/mL，結果見圖3-A。據此，檢測在生藥質量濃度為150 mg/mL時10個批次WECT對TGF-β1誘導的肝纖維化模型細胞中mRNA表達量的抑制率，評價不同批次鱉甲藥材的抗肝纖維化生物活性，結果見圖3-B。

A-10批鱉甲藥材的近紅外光譜數據 B-經一階導數處理后的10批鱉甲藥材的近紅外光譜信息

表3 10批鱉甲藥材（S1～S10）的相似度分析

A-WECT對肝纖維化模型細胞中COL1 mRNA相對表達量的EC50 B-10批WECT對COL1 mRNA表達量的抑制率

3.4 鱉甲藥材效應近紅外譜的建立與應用

對10批鱉甲藥材的近紅外光譜數據和鱉甲對TGF-β1誘導的肝纖維化模型細胞中mRNA相對表達量的抑制率進行相關性分析，共篩選得到＞0.6、＜0.05，且波數大于8 cm?1的活性波段3個，分別為5226～5235 cm?1、5943～6071 cm?1與6379～6396 cm?1（圖4-A、B）。為進一步探究各活性波段與鱉甲藥材抗肝纖維化生物活性的相關性，以各活性波段下面積為指標構建鱉甲藥材的效應近紅外譜（圖4-C），結果表明不同鱉甲藥材的效應近紅外譜之間存在一定的差異性。將各效應波譜下面積和作為鱉甲藥材的質量評價系數，用于評價鱉甲藥材的質量，結果表明鱉甲藥材的抗肝纖維化活性與質量評價系數呈顯著正相關（＝0.886 23，圖4-D）。

3.5 鱉甲藥材效應近紅外譜的驗證

為進一步驗證質量評價方法的科學性，本研究另取8批鱉甲藥材（S11～S18），采集其近紅外光譜信息并進行一階導數處理，結果見圖5-A。測定其抗纖維化活性，結果見圖5-B。計算各特征波段下的面積，建立效應近紅外光譜，見圖5-C。隨后計算各批次藥材的質量評價系數（質量評價系數＝SW1＋SW2＋SW3，SW1、SW2、SW3分別表示5226～5235 cm?1、5943～6071 cm?1與6379～6396 cm?13個波段下的面積和），并將各批次藥材的質量評價系數與與其抗肝纖維化活性進行相關性分析（圖5-D），結果顯示兩者呈顯著正相關（＝0.813 53），這表明基于鱉甲效應近紅外譜構建的鱉甲質量評價系數能夠較好評價鱉甲抗肝纖維化生物活性。

A-10批WECT近紅外光譜信息與其生物活性的相關性分析結果 B-活性波段篩選示意圖 C-10批鱉甲藥材的效應近紅外譜 D-10批鱉甲藥材的質量評價系數與生物活性相關性分析結果圖，其中質量評價系數＝SW1＋SW2＋SW3，SW1、SW2、SW3分別表示5226～5235 cm?1、5943～6071 cm?1與6379～6396 cm?1 3個波段下的面積和

A-8批驗證藥材的近紅外光譜信息 B-8批驗證藥材的抗肝纖維化生物活性 C-8批驗證藥材活性波段下效應近紅外譜 D-效應近紅外譜與生物活性相關性分析

4 討論

鱉甲在臨床應用廣泛，以鱉甲為君藥的復方鱉甲軟肝片對肝纖維化及早期肝硬化的療效顯著，是我國為數不多的用于治療肝纖維化的藥物[14]。近年來不少學者，基于生物評價建立了反映中藥功效與毒性、中藥制劑的一致性等的評價方法，但對于以鱉甲為例的藥效物質尚不明確的動物藥的質量評價研究較少[15]。因此關聯生物活性的質量評價方法建立對于鱉甲的開發與利用有著重要意義[16]。據此，本研究以鱉甲為模式藥物，結合鱉甲的抗肝纖維化生物活性與鱉甲藥材近紅外指紋圖譜，通過譜-效相關分析，探究鱉甲的活性波段，用于鱉甲的質量評價，以期為動物藥質量控制模式的建立與健全提供參考。

首先，本研究在細胞水平證實了鱉甲水提物的抗肝纖維化生物活性，實驗表明，WECT可以減少TGF-β1誘導的肝纖維化LX-2細胞模型中mRNA及蛋白的表達，這提示WECT可能通過抑制ECM的沉積而發揮抗肝纖維化生物活性；在此基礎上，本研究基于WECT對肝纖維化細胞模型中mRNA表達量的抑制率，建立了鱉甲藥材生物活性評價方法；并通過對生物活性與近紅外光譜數據進行相關性分析，篩選出具有高相關性的3個活性波段，分別為5226～5235 cm?1、5943～6071 cm?1與6379～6396 cm?1，以此3個活性波段下面積為指標建立了鱉甲抗肝纖維化效應近紅外譜，以效應近紅外譜下面積和，作為質量評價系數，并應用于鱉甲藥材質量評價，結果顯示，質量評價系數與抗肝纖維化生物活性呈正相關且相關性良好，這提示基于效應近紅外譜建立鱉甲的質量評價系數，在一定程度上能夠區別不同鱉甲的抗肝纖維化生物活性。

綜上，本研究以鱉甲為例，首先在細胞水平驗證了鱉甲的抗肝纖維化生物活性，通過近紅外光譜數據的分析與抗肝纖維化活性評價，建立了鱉甲效應近紅外譜，并通過計算鱉甲的質量評價系數，實現了對鱉甲功效質量的評價，為鱉甲藥材的開發與利用提供了有力保障，從而為鱉甲及動物藥質量評價方法的建立或建全提供了新的線索。此外，基于效應近紅外譜活性波段的鱉甲質量評價，是關聯生物活性、操作相對簡便的質量評價方法，可為其他動物藥質量評價方法的建立或完善提供一定參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation ofbased on anti-liver fibrosis biological activity and effect-related near-infrared spectrum

CAO Meng-zhen1, 2, HUANG Qian2, NIU Ming2, ZHAO Xu2, XIAO Xiao-he1, 2

1. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610032, China 2. Department of Hepatology, the Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100039, China

To explore the biological activity evaluation method of Biejia () quality related to anti-hepatic fibrosis activity based on its clinical anti-hepatic fibrosis effect and combined with near-infrared spectroscopy.Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) induced LX-2 liver fibrosis cell model was established, qRT-PCR was used to detect the effect ofon type I collagen () mRNA expression, the inhibition rate ofmRNA expression was calculated; Western blotting was used to detect the effect ofon COL1 protein expression to evaluate the anti-hepatic fibrosis bioactivity ofon cell model. Near-infrared spectral data of different batches ofwere collected and processed, the correlation between near-infrared spectral data ofand their anti-liver fibrosis activity through spectrum effect correlation analysis was explored, and the active band was screened. The effect-near infrared spectrum ofwas established, and the area under the effect near infrared spectrum was used to evaluate the quality of.experiments showed that compared with model group,mRNA and protein expressions in water extract of(WECT) were significantly decreased (< 0.05, 0.01). Based on spectrum effect correlation analysis, three active bands with> 0.6,< 0.05 and wave number greater than 8 cm?1were screened, which were 5226—5235 cm?1, 5943—6071 cm?1and 6379—6396 cm?1, respectively. Taking the area under the three active wavebands as the index, the effective near-infrared spectrum ofwas established, the area sum under each characteristic waveband was calculated, and its correlation with biological activity was analyzed. The correlation coefficient between the two was= 0.813 53.WECT can inhibit the production of LX-2 extracellular matrix to treat liver fibrosis; The sum of the area under the effect spectrum (5226—5235 cm?1, 5943—6071 cm?1and 6379—6396 cm?1) is used as the quality evaluation coefficient ofto evaluate the quality of, which can distinguish the anti-liver fibrosis activity of different batches ofmedicine.

; liver fibrosis; quality evaluation; biological evaluation; near-infrared spectroscopy; spectrum-effect correlation analysis

R285.5

A

0253 - 2670(2023)10 - 3150 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.012

2023-01-16

國家自然科學基金重點項目（81930110）；國家中醫藥傳承創新團隊項目（ZYYCXTD-C-202005）

曹夢珍（1997—），女，碩士研究生。E-mail: Caomengzhen1213@163.com

肖小河，主要從事中藥鑒定學和臨床中藥學工作。Tel: (010)66933322 E-mail: pharmacy302xxh@126.com

趙 旭，主要從事天然藥物化學研究。E-mail: xuzhao080@outlook.com

[責任編輯 李亞楠]