星點設計響應面法優化白木香葉黃酮類化合物提取工藝

◎ 李俊毅，黃 忻，吳漫曄，黃乾峰，倪少義 ，陳麗玲，吳道偉，王偉斌，林昭亮

（1.揭陽市食品檢驗所，廣東 揭陽 522000；2.揭陽職業技術學院，廣東 揭陽 522000）

白木香是瑞香科，沉香屬的喬木，別稱沉香、土沉香、牙香樹等，作為我國珍貴藥用植物主要分布于我國海南、云南、福建、兩廣等地[1]。國產中藥沉香，是其樹木生長過程中受蟲蛀、刀斧雷劈、獸咬等外界刺激，樹體表面損壞后自我修復時，被真菌寄生所堆積形成的香脂，可以入藥。白木香葉為沉香的非藥用部分，依據文獻[2]，白木香葉茶具有促進小腸蠕動、安神助眠、益氣益精等保健功效，白木香葉主要活性成分之一是黃酮類化合物[3]，具有抗氧化、抗炎、降血脂、抑菌、提高免疫力等作用。廣東省是白木香的重要產區，白木香葉產量高，具有廣闊的發展前景。然而，目前對白木香葉中黃酮類化合物提取工藝的研究尚未見相關報道。本文以廣東揭陽普寧產的白木香葉為原料，以白木香葉黃酮類化學成分為研究對象，采用星點設計響應面法對其提取工藝進行優化，為白木香葉產品的開發和資源利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

白木香葉取自2020年12月廣東省揭陽市普寧普僑區，經廣東省揭陽市中醫院主任中藥師楊曉平鑒定為瑞香科沉香屬白木香的葉，粉碎備用。

蘆丁標準品：HPLC ≥98%，源葉生物，批號：Y24F11Y17051；NaOH：分析純，廣州化學試劑廠；NaNO2：分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；Al（NO3）·9H2O：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

中藥材粉碎機：SF130，福州法莫優科；電子分析天平：十萬分之一，BT 125D，德國賽多利斯；電子分析天平：萬分之一，FA2004，舜宇恒平儀器；紫外-可見分光光度計：UV-1800，島津；恒溫水浴鍋：HH-ZK4，上海昆聚儀器設備有限公司。

1.3 黃酮類化合物測定方法

1.3.1 標準曲線的建立

精密稱定蘆丁標準品10 mg，加入50 mL 80%的乙醇，配制0.2 mg·mL-1的貯備液，移液管分別移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 該溶液于10 mL 具塞試管中，加入蒸餾水至5 mL，采用硝酸鋁顯色法[4-8]，分別向其中加入5% 亞硝酸鈉0.5 mL，靜置6 min，再加入10%硝酸鋁0.5 mL，再放置6 min，接著向其中加入1 mol·L-1氫氧化鈉4.0 mL，靜置15 min。同時用蒸餾水代替蘆丁試劑做空白對照，在波長為510 nm 下測定各溶液吸光度，以蘆丁(總黃酮)質量濃度(C，mg·mL-1)為橫坐標，吸光度值(A)為縱坐標，繪制蘆丁質量濃度與吸光度的標準曲線。標準曲線為：A=11.983 C-0.040 9（R2=0.999 2，n=5），結果表明：在0.021 48 ～0.107 40 mg/mL 時，蘆丁質量濃度與吸光度呈良好的線性關系。

1.3.2 黃酮類化合物的測定方法

準確移取1 mL 白木香葉提取液于10 mL 具塞試管中，操作步驟同上，以試劑空白作對照，最后于波長510 nm 下比色，計算黃酮類化合物含量和得率。計算公式如下：

式中：C為計算的白木香葉總黃酮的濃度，mg·ml-1；V為提取溶液體積，mL；n為提取溶液稀釋倍數；m為所用白木香葉質量，g。

1.4 白木香葉總黃酮類化合物提取工藝優化試驗

1.4.1 提取方法比較

分別采用醇浸漬提取法、醇溶劑回流提取法和超聲輔助提取法[9]對白木香葉黃酮類成分進行提取，通過比較得率的大小選取合適的提取方法。

1.4.2 醇浸漬提取法

稱取白木香葉2 g，加入80 mL 60%乙醇，室溫下浸漬2 h，過濾，將濾液定容至80 mL，測定吸光度，計算黃酮類化合物得率。

1.4.3 醇溶劑回流提取法

稱取白木香葉2 g，加入80 mL 60%乙醇，水浴回流2 h，過濾，將濾液定容至80 mL，測定吸光度，計算黃酮類化合物得率。

1.4.4 超聲輔助醇提取法

稱取白木香葉2 g，加入80 mL 的60% 乙醇，超聲提取40 min，過濾，定容至80 mL，測定吸光度，計算黃酮類化合物得率。

1.5 單因素試驗

分別選取乙醇體積分數、料液比、提取時間作為主要考察因素，探究對白木香葉黃酮類化學物提取的影響，確定各影響因素曲面響應優化范圍。

1.5.1 乙醇體積分數對黃酮類化合物得率的影響

稱取白木香葉2 g，固定料液比(g·mL-1)為1:40，分別加入體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，水浴回流提取2 h，趁熱過濾，將濾液定容至80 mL，測定吸光度，計算黃酮類化合物得率。

1.5.2 料液比對黃酮類化合物得率的影響

稱取白木香葉2 g，分別按照料液比（g·mL-1）為1:20、1:25、1:30、1:40、1:50 加入體積分數為60%的乙醇溶液，水浴回流提取2 h，趁熱過濾，將濾液分別定容至提取前體積，測定吸光度，計算黃酮類化合物得率。

1.5.3 提取時間對黃酮類化合物得率的影響

稱取白木香葉2 g，固定料液比(g·mL-1)為1:40，加入體積分數60%的乙醇溶液，分別水浴回流提取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、5.0 h，趁熱過濾，將濾液定容至80 mL，測定吸光度，計算黃酮類化合物得率。

1.6 星點設計響應面法（CCD）優化提取工藝

選取乙醇體積分數、料液比、提取時間作為主要影響因素[10-11]，以白木香葉黃酮類化合物得率為響應值，采用CCD 設計原理，通過三因素五水平設計，優化白木香葉黃酮類化合物提取工藝，影響因素及水平設計如表1 所示。

表1 星點設計因素水平表

2 結果與分析

2.1 提取方法比較結果

3 種提取方法對白木香葉黃酮類化合物的提取結果如表2 所示，在固定提取溶劑體積為60%和料液比為1:40 時，醇溶劑回流提取法對黃酮類化合物提取率為2.89%，提取效果最佳。因此，本研究采用此法繼續對單因素和星點設計響應面法進行提取工藝考察。

表2 不同提取方法提取白木香葉黃酮類成分結果表

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對得率的影響

圖1 為乙醇體積分數對得率的影響。由圖1 可以看出：當乙醇體積分數小于70%時，白木香黃酮類化合物得率隨其增加逐漸增大；在體積分數為70%時，得率最大；當體積分數大于70%時，體積分數增加，黃酮類化合物得率減小，這可能是由于乙醇體積分數較高時，白木香葉中油脂和葉綠素等雜質的溶解率增加，極性較大的黃酮類化合物溶出減少，得率下降。因此，選取乙醇體積分數為50%～70%為后續優化試驗考察范圍。

圖1 乙醇體積分數對得率的影響

2.2.2 料液比對得率的影響

圖2 為料液比對得率的影響。由圖2 可知，在料液比為1:20 ～1:40 的范圍內，料液比對白木香葉黃酮類化合物得率的影響是顯著的，料液比越大，得率越大；當料液比為1:40 時，得率最大為2.35%；當料液比繼續增加時，得率略微下降。這是由于在一定的料液比時，黃酮類化合物已基本完全溶解，因此，選擇料液比為1:25 ～1:40 為后續優化試驗考察范圍。

圖2 料液比對得率的影響

2.2.3 提取時間對白木香葉總黃酮得率的影響

圖3 為提取時間對得率的影響。由圖3 可知，提取時間對白木香葉黃酮類化合物的影響較為顯著，提取時間為0.5 ～2.0 h 時，隨著提取時間的延長，得率呈上升趨勢，但得率僅增加0.13%，增速較為緩慢；提取時間為2 ～3 h 時，得率增加0.23%，提取時間的延長能夠明顯提高得率；當提取時間大于3 h 時，得率下降，這是由于加熱時間過長可能會破壞黃酮類化合物某些熱敏性組分，因此提取時間不宜過長，故選擇提取時間1.5 ～3.0 h 為后續優化試驗考察范圍。

圖3 提取時間對得率的影響

2.3 響應面法優化提取工藝

2.3.1 模型擬合和統計分析結果

表3 為星點設計試驗及結果表。根據CCD 試驗設計原理，以白木香葉黃酮類化合物為響應值，通過三因素五水平試驗，設計優化提取工藝，由軟件Design-Expert 12.0 對表3 中影響因素和響應值進行多項式模型擬合和回歸分析，得到如下方程：

表3 星點設計試驗及結果表

回歸模型方差分析結果如表4 所示，該模型決定系數R2為0.933 7，F 值為15.66，失擬項P ＞0.1 時不顯著，當P ＜0.000 1 時極為顯著，說明該二項式模型擬合程度較高，能準確預測實際情況。其中，單因素對響應值影響程度較大，依次為B（料液比）＞C（提取時間）＞A（乙醇體積分數），二次項中影響程度較大的為B2和C2，而交互項影響程度則較小。

表4 回歸模型方差分析結果表

2.3.2 響應面優化結果

回歸方程響應面分析結果如圖4 所示，可通過分析3D 曲面圖的傾斜度確定交互項對響應值的影響程度，傾斜度越大，交互作用越強。由結果可知，除了AC 交互項之外，AB 和BC 交互項形成的曲面具有較大的傾斜度，對白木香葉黃酮類化合物得率具有較大的影響。通過軟件Degisn-Expert 12.0 對二項式回歸模型分析，得出白木香葉黃酮類化合物最佳提取條件為乙醇體積分數70%，料液比1:40，提取時間2.992 h，為了方便操作，將提取時間修改為3 h，此工藝條件下，模型預測得率為3.14%。應用此工藝條件提取黃酮類化合物穩定性結果如表5 所示，得率的均值為3.10%，與模型預測值3.14%較為接近，說明該二項式回歸模型以及該回歸方程具有可靠性，能較好地反映實際提取情況。

表5 工藝穩定性結果表

圖4 各交互因素對白木香葉黃酮類化合物得率的影響圖

3 結語

本文以廣東揭陽產的白木香葉為主要原料，以黃酮類化合物得率為指標，綜合對比了幾種常見的黃酮類化合物提取方法，結果表明，醇溶劑回流提取法能有效提高得率。經過單因素試驗確定影響因素考察范圍，采用星點設計響應面法，對其提取條件進一步優化后得到的最佳提取工藝為：乙醇體積分數70%，料液比1:40，提取時間3 h，驗證試驗的結果表明本模型預測精度高，擬合效果良好，可為白木香葉資源的有效利用提供依據。