HPLC-MS/MS 同時測定紹興黃酒中15 種活性成分的含量

◎ 倪慧慧，錢 菁，章媛媛，求杰英，楊慧萍，陳媛媛

（1.新昌縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江 新昌 312500；2. 新昌縣市場監督管理局，浙江 新昌 312500）

黃酒源于中國，且唯中國有之，其釀造和飲用歷 史已有5 000 余年，是我國傳統的發酵食品，在世界三大釀造酒（黃酒、葡萄酒和啤酒）中占有重要地位，被稱為“國酒”[1]。黃酒的釀造主要選用稻米、黍米、小米、小麥等為原料，經選米、浸泡、蒸米、加曲、糖化、發酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌等多個環節制作而成[2]，其特殊的釀造工藝會產生和保留許多對人體有益的活性和功能性成分，如氨基酸、核苷、生物堿等[3-6]，具有較高的營養保健價值，周建弟等[7-9]發現黃酒具有抗氧化、增強體質、提高新陳代謝、保護心血管功能等生理功效。

在民間，黃酒的藥用功能早被先人所知，自古以來被認為是“百藥之長”，具有通絡、益氣、活血、行氣等保健作用，特別是在許多中醫方子中常將黃酒作為藥引。據中醫典籍《湯液醪醴論》記載，黃酒“得天地之和，高下之宜，故能至完，伐取得時，故能至堅也”。李時珍在《本草綱目》中也多次提及，黃酒入藥有行藥勢之功效，可見黃酒是中醫藥上重要的輔料和藥引子[10]。因此，充分了解中國傳統黃酒的營養、保健功能尤為重要，這能從根本上改變消費者對黃酒的認知。

現有文獻顯示，對于黃酒中活性物的研究目前只停留在定性的基礎上，尚缺乏深入研究，因此，必須加強對黃酒中有效成分的研究，以推進我國黃酒產業的發展。目前市場上黃酒的品牌很多。其中，浙江紹興黃酒是黃酒中地位顯著、歷史悠久、最有代表性的產品，其以精白糯米、優質小麥和鑒湖水為主要原料，采用自然發酵工藝釀造而成的優質黃酒，本試驗以高品質的傳統紹興黃酒為試驗對象，使用HPLC-MS/MS 對黃酒中篩選的活性物含量進行測定，可以為黃酒的保健功能提供一定的科學依據，提升黃酒的知名度和價值，從而加快黃酒產業的發展。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

Agilent 1260-6470 高效液相—三重四級桿串聯質譜(美國Agilent 公司)；KQ-5200B 超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司，超聲功率500 W，40 kHz)；BSA2245 型電子分析天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 試劑

對 照 品 組 胺（ 批 號70678）、 賴 氨 酸（ 批號710001）、精氨酸（批號71197）、胞苷（批號70160）、腺苷（批號70166）、纈氨酸（批號77288）、脯氨酸（批號77408）、尿苷（批號70164）、胸苷（批號 200202）、肌苷（批號70691）、4-氨基丁酸（批號77415）、酪胺（批號77616）、鳥苷（批號71086）、色胺（批號71579）、反-對香豆酸（批號71726）購自壇墨質檢科技有限公司，純度＞98%。試驗用水為超純水(由Millipore 純水器制備)，甲醇為色譜純(德國默克公司)；甲酸、甲酸銨(色譜純，Macklin 公司)。試樣為市售的不同品牌黃酒，黃酒品牌具體信息如表1 所示。

表1 不同品牌黃酒名稱、發酵年份及廠家信息表

2 試驗方法

2.1 溶液配制

精密稱取對照品組胺、賴氨酸、精氨酸、胞苷、腺苷、纈氨酸、脯氨酸、尿苷、胸苷、肌苷、4-氨基丁酸、酪胺、鳥苷、色胺、反-對香豆酸各5.00 mg，置于10 mL 容量瓶，分別加水定容至刻度（加入1 mol·L-1NaOH 溶液助溶），得最終濃度為0.5 mg·mL-1的對照品儲備溶液，儲備液分別用水稀釋成一定濃度，最終配制混合對照品儲備液，4 ℃存放備用。

2.2 供試品溶液的制備

將不同品牌待測黃酒過0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 HILIC-Z（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）。流動相：A，水(含0.1%甲酸和5 mmol甲酸銨)；B，甲醇。柱溫：40 ℃。進樣量：1 μL。梯度洗脫條件表見表2。

表2 梯度洗脫條件表

2.4 質譜條件

離子源：ESI 源；電噴霧電壓：3 500 V；干燥氣和碰撞氣：氮氣；離子源溫度：300 ℃；霧化器壓力：310.275 kPa；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流：11 L·min-1。采用MRM 模式對樣品進行定量分析。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察

精密吸取混合對照品儲備液適量，用水將其稀釋至不同濃度，進行測定，記錄各成分的色譜峰面積，以色譜峰面積積分值（Y）為縱坐標，對照品溶液的濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線。

2.5.2 精密度試驗

取混合對照品儲備液稀釋至一定濃度，重復測定6 次，以色譜峰面積積分值計算相對標準偏差(RSD)。

2.5.3 重復性試驗

取同一批樣品，按供試品制備方法平行制備6 份，分別進樣測定，記錄色譜峰面積積分值，計算RSD。

2.5.4 穩定性試驗

取同一供試品溶液放置0，1，4，6，12，24，48 h后進樣測定，記錄色譜峰面積積分值，計算RSD。

2.5.5 回收率試驗

取供試品儲備液，用水稀釋至一定含量，精密量取已知含量的供試品溶液9 份，每份1 mL，分成3 組，每組3 份，分別精密添加相當于已知含量的15 種對照品的混合對照品溶液0.5，1.0，1.5 mL，制備供試品溶液進樣測定，計算平均回收率及RSD。

2.5.6 含量測定

分別精密吸取14 批不同品牌的黃酒，制備供試品溶液進樣測定，記錄色譜峰面積，代入標準曲線進行計算。

3 試驗結果及分析

3.1 質譜條件優化

通過核苷、生物胺和氨基酸的結構可知，其在正離子模式下電離較為穩定，且正離子模式下核苷、生物胺和氨基酸具有較高的靈敏度和較清晰的質譜圖，更易確認分子離子峰。因此，選擇正離子模式作為核苷、生物胺和氨基酸的離子化模式。15 種成分的質譜具體參數、提取離子色譜圖分別見表3 及圖1。

圖1 15 種成分的提取離子流圖

表3 對照品質譜信息表

（續表3）

3.2 色譜條件優化

HILIC 模式色譜柱適用于分析在反相色譜柱上沒有保留的極性或強化合物，對強極性物質有很好的保留，本試驗選擇HILIC-Z 色譜柱進行分離。另外，對流動相（甲醇-水、乙腈-水）、添加劑（甲酸銨、乙酸銨等）、柱溫等進行考察，結果表明：采用水( 含0.1% 甲酸和5 mmol 甲酸銨) 及甲醇作為流動相時，可以提高檢測靈敏度和改善化合物的峰形，各物質的響應也有所提高。

3.3 方法學考察結果

15 個成分的線性方程及范圍如表4 所示。由表4可知，各化合物峰面積響應值與濃度呈良好的線性關系，其相關系數均大于0.999，可滿足檢測需求。精密度、重復性、穩定性結果見表5，15 個成分的峰面積RSD 均小于5%，說明儀器精密度良好，該方法重復性良好，供試品在48 h 內較穩定。加樣回收試驗中，15 個成分的加樣回收率均在95%～110%，RSD在0.35%～4.18%，表明方法準確度良好，加樣回收率結果見表6。

表4 15 個成分的線性方程、相關系數及范圍表

表5 15 個成分的精密度、重復性、穩定性結果表

表6 15 個成分的加樣回收率結果表

3.4 樣品含量測定

通過文獻和試驗研究，從黃酒中篩選15 種活性化合物，14 批不同品牌黃酒制備的供試品溶液中含量結果見表7。結果表明，14 批黃酒均檢測出組胺、色胺、酪胺、精氨酸、纈氨活性物酸、脯氨酸、賴氨酸、胞苷、尿苷、胸苷、4-氨基丁酸。不同品牌黃酒中精氨酸和賴氨酸含量都較高，且隨著釀造年份的增長，不同氨基酸含量逐年遞增；核苷類成分（腺苷、鳥苷、胸苷等）在大部分品牌黃酒中都能鑒定到，核苷具有抗血小板聚集、抗心律失常、舒張血管等藥理活性，有學者[11-13]認為核苷可能是補益食品的共同物質基礎，是發揮黃酒保健功能的有效成分之一；其余成分（生物胺類、有機酸類等）在不同品牌黃酒中的含量差異不大。

表7 14 批不同品牌黃酒制備的供試品溶液活性物含量結果表（單位：μg·mg-1）

4 結論

黃酒是中國古老的酒種，被譽為“國粹”，深受消費者的喜愛，且具有營養保健功能，正逐步得到消費者的認可。本試驗通過優化試驗條件和色譜方法，建立了HPLC-MS/MS法同時測定紹興黃酒中氨基酸、核苷、生物胺、有機酸等成分的含量，該方法前處理簡便，重復性、精密度、穩定性均滿足定量分析要求，測定結果準確可靠，從而為檢測黃酒中活性成分的含量提供可靠試驗方法，同時為更好地研究黃酒中的活性成分提供一定技術支持。