高效液相色譜法測定蜂蜜中氧氟沙星殘留

◎ 高倩妮，魏超田，陸 寧，姚夢靖，周曉龍

（1.亳州學院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800；2.藥食同源功能食品亳州市重點實驗室，安徽 亳州 236800）

由于蜂蜜具有保健作用的特殊性，其質量問題被廣大消費者關注。為了避免蟲害，蜂農會給蜜蜂身上噴曬抗菌藥——氧氟沙星，氧氟沙星是屬于喹諾酮類中的一種具有廣譜性的抗菌藥[1]，蜂蜜在養殖加工過程中如檢測出氧氟沙星則被判定不合格[2]。近年來，蜂蜜中喹諾酮類檢出率也有逐年增加的趨勢，學術研究者不斷探索蜂蜜中氧氟沙星的檢測方法[3]。目前，測定氧氟沙星殘留量的方法有免疫芯片法[4-5]、氣相色譜法[6]、氣相質譜色譜聯用法[7]、高效液相色譜-串聯質譜方法[8]。質譜法的檢出限最低，但操作復雜、煩瑣、耗時且設備條件和成本大。因此，質譜法難以普及。由于蜂蜜有一定的粘稠特性，所以，不能使用畜產品的前處理方法。本文研究前處理方法，固相萃取蜂蜜中的氧氟沙星，探究流動相組成、流速和比例，研究開發高效液相色譜法測定氧氟沙星，其方法簡單、成本低、效率高、實用性強，為快速檢測蜂蜜產品中的目標物含量提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧氟沙星的標準液（100 μg·mL-1，壇墨質檢科技股份有限公司），乙腈（色譜純）、無水硫酸鎂、甲酸、乙酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀均為國藥分析純，蜂蜜市售。

1.2 儀器設備

HPLC（世爾科技有限公司）；固相萃取儀（天津東康科技有限公司）；FN-12W 型氮吹儀（天津富達科技有限公司）；YP-5006 型百分之一天平（上海越平科技儀器有限公司）；AcclaimTMPolarAdvantage II C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.3 實驗方法

1.3.1 氧氟沙星標準溶液配制

準確量取200 μL 氧氟沙星標液（100μg·mL-1），用0.2%甲酸水溶液定容至1 mL 配制成20.00μg·mL-1標準儲備液，儲備于冰箱中備用。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱為C18柱；檢測波長為280 nm 的激發波長，450 nm 的發射波長；柱溫為30 ℃；流速為1.5 mL·min-1；進樣量為10 μL；流動相體積比例為13:87（流動相A 為乙腈，流動相B 為0.2%甲酸水溶液）。依據以上色譜條件，檢測流動相種類（乙腈/0.2%甲酸、0.05 mol·L-1磷酸溶液/三乙胺-乙腈），流速及流動相比例，樣品不同前處理等因素對氧氟沙星分離效果的影響，確定最終色譜條件，通過標準曲線測定、精密度實驗、回收率測定考察儀器方法的精密性、準確性和穩定性。

1.3.3 蜂蜜樣品處理

蜂蜜稀釋液的選擇，一般樣品分別用水、0.02 mol·L-1的氫氧化鈉和Mallvaine pH 為4.0 的緩沖液溶解蜂蜜，再用0.5%乙酸乙腈提取氧氟沙星。用2 mL 甲醇、磷酸緩沖鹽分別預淋萃取柱，上清液過柱，甲醇洗脫，吹至近干，定容至2 mL，過0.45 μm 有機濾膜。

研究提取液對氧氟沙星提取量的影響，提取液為0.05 mol·L-1磷酸緩沖鹽、0.5%乙酸的乙腈和乙腈+水（8:2）混合溶液。

2 結果與討論

2.1 色譜條件

2.1.1 流動相的選擇

流動相為磷酸溶液/三乙胺-乙腈時，氧氟沙星出峰時間較為延遲，為10.776 min，且基線不穩定，雜峰較多，分離效果不好；流動相為甲酸—乙腈時，氧氟沙星出峰時間為7.773 min，節約時間且基線穩定，有對稱尖銳的峰型，分離效果較好，信噪比更高，定甲酸水溶液和乙腈（87:13）為選擇流動相進行等度洗脫，時間為18 min。

2.1.2 流速優化

目標物出峰時間隨流速增加而縮短，出峰時間為6.775 min，此時流速為1.8 mL·min-1，峰前有拖尾的狀況，有明顯現象，基線不穩；流速為1.2 mL·min-1時，峰前拖尾現象，明顯基線不穩，出峰時間為8.626 min；流速為1.5 mL·min-1時，出峰時間為7.648 min，出現無拖尾現象且鋒型較為尖銳對稱的峰圖，因此，最終選擇1.5 mL·min-1的流速。

2.2 優化樣品前處理條件

2.2.1 確定初方法

以磷酸緩沖鹽、乙酸的乙腈和乙腈+水（8:2）混合溶液為蜂蜜中氧氟沙星的提取液，同體積添加的3種提取液中的氧氟沙星含量經高效液相測定結果分別為0、1.152 0 和0.951 9 ng·g-1，故選擇氫氧化鈉溶液作為蜂蜜樣品中稀釋液，乙酸的乙腈溶液作為蜂蜜稀釋液中氧氟沙星的提取液。

2.2.2 方法的進一步確定與優化

研究分析兩因素對實驗結果的影響，結果分析表見表1。由表1 可知，氫氧化鈉: 蜂蜜=1:1，蜂蜜: 乙酸乙腈=1:5 時，提取效果最佳，提取量為1.612 ng·g-1。

表1 氫氧化鈉和乙酸乙腈溶液對提取氧氟沙星的影響表ng·g-1

2.3 儀器方法驗證

2.3.1 標準曲線及線性范圍

將氧氟沙星標準液的濃度配制成0.016、0.032、0.080、1.000、10.000、20.000 μg·mL-1。縱坐標（Y)為峰面積，橫坐標為進樣濃度（X)，擬合標曲方程為：Y=737 745.075 9X-33 501.592 5，R2=0.997 6。在0.016～20.000 μg·mL-1濃度范圍內，線性關系良好。

2.3.2 精密度與檢出限

測定6 次，吸取標液0.032 μg·mL-1得到組分為2.24%的相對標準偏差（RSD）。添加0.8 μg·kg-1標液于空白蜂蜜基質，信噪比（S/N)＞10，說明定量限可達到0.8 μg·kg-1，該方法可以滿足分析要求。

2.3.3 回收率實驗

取100 μL 的0.05、0.10 和0.5 μg·mL-1的標液放入5 g 蜂蜜空白樣中，做3 次加標回收重復試驗。回收率為84.38%～99.41%，相對標準偏差RSD 為2.25%，滿足線性分析要求。

3 結語

將方法應用于市場，在市場上的蜂蜜樣品中選取5 種品牌3 個種類的椴樹蜂蜜、洋槐蜂蜜及老蜂蜜檢測，共抽檢了5 份。優化后的色譜條件：流動相為乙腈-2%甲酸水溶液（13:87），1.5 min·L-1的流速，35 ℃的柱子溫度，280 nm，450 nm 發射波長。此方法條件下，檢測氧氟沙星0.8 μg·kg-1的檢出限，在0.016 ～20.000 μg·mL-1濃度范圍內氧氟沙星測定呈良好的線性關系，相關系數R2=0.997 6，加標回收率為84.38%～99.41%，本方法能夠滿足殘留分析的要求。一種簡便準確又快捷的方法，檢測蜂蜜及類似產品中可能存在的氧氟沙星殘留量，一定程度上可以保障蜂蜜產業的安全生產。