鱷蜥源葡萄牙檸檬酸桿菌和摩氏摩根菌的分離鑒定及藥敏分析

呂美，郭怡德，陳耀還，羅文賢，曾曉晨，江海英，陳金平，靖元孝

（1.華南師范大學生命科學學院，廣州，510631；2.廣東省科學院動物研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣州，510260；3.廣西大桂山鱷蜥國家級自然保護區管理中心，賀州，542800）

鱷蜥（Shinisaurus crocodilurus）隸屬于爬行綱（Reptilia），有鱗目（Squamata），鱷蜥科（Shinisauri?dae），鱷蜥屬（Shinisaurus），是國家一級重點保護野生動物，世界自然保護聯盟（IUCN）瀕危（EN）物種［1］，CITES 附錄Ⅰ物種［2］，主要分布在我國廣東、廣西和越南東北部廣寧省安圖自然保護區［3］。為了促進鱷蜥種群數量復壯，人工救護繁育成為保護鱷蜥的重要措施，并取得了較好的效果［4］。但有研究表明，由于環境的限制，人工繁育的鱷蜥常會受到一些疾病的侵襲，導致鱷蜥死亡［5］，這些疾病主要包括因感染龜嗜皮菌（Austwickia chelonae）造成的皮膚肉芽腫?。?］，感染銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）造成的皮膚潰瘍?。?］等。

檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和摩氏摩根菌屬（Morganella）細菌廣泛存在于水、土壤等自然環境以及動物的腸道中，為常見的條件致病菌和人獸共患病原菌，易造成動物腹瀉、繼發感染等疾病。近年來，已有許多關于檸檬酸桿菌屬感染動物的報道，如弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）可引起加州鱸（Micropterus salmoides）［8］、牛 蛙（Rana catesbeiana）［9］和巴西龜（Trachemys scripta elegans）［10］等水生動物體表局部充血、出血和潰爛等癥狀。布氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii）可引起菌血癥［11］。葡萄牙檸檬酸桿菌（C.portucalensis）可導致星點水龜（Clem?mys guttata）精神狀態差、食欲減退和眼睛炎癥等［12］。摩氏摩根菌（Morganella morganii）可感染水生動物，主要癥狀表現為患病動物食欲不振、甚至廢絕，精神狀態差，體表皮膚潰爛和出血等，如黃喉擬水龜（Mauremys mutica）感染該菌后會行動遲緩、食欲廢絕、爪脫落和頭肢部潰爛等［13］，中國大鯢 （Andrias davidianus）感染后表現為拒食、行動遲緩和體表有出血點等［14］，胡子鯰（Clarias fuscus）感染后表現為體表有大量黏液、腹部腫大和肛門紅腫等［15］。

2021 年7 月，在廣西大桂山鱷蜥國家級自然保護區北婁管理站發現一些鱷蜥發生嚴重感染并有零星死亡。通過形態學觀察、生理生化試驗、分子生物學方法和藥敏試驗，并結合多位點序列分型（multilo?cus sequence typing，MLST）方法探究鱷蜥感染的病原，旨在為鱷蜥細菌性疾病的預防控制提供理論依據。

1 試驗材料

廣西大桂山鱷蜥國家級自然保護區北婁管理站救護繁育的鱷蜥于2021年7月發生細菌性感染疾病，導致零星死亡。鱷蜥生前的臨床表現為四肢無力，行動遲緩、甚至停滯，精神萎靡，反應遲鈍，食欲不振。

2 試驗方法

2.1 病原菌分離與培養

將鱷蜥尸體無菌解剖，取肺和肝組織劃線接種于胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）上，倒置在恒溫生化培養箱中30 ℃培養18～24 h 后，挑選形狀一致的優勢菌落純化，直至獲得形態大小一致的純菌落。挑取純菌在胰酪大豆胨液體培養基（TSB）中28 ℃培養12～16 h，加終濃度為20%的甘油，置于冰箱中?80 ℃保存備用。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態和生理生化鑒定

將在超低溫冰箱中保存的菌株活化后，劃線接種于營養瓊脂培養基上，30 ℃培養24 h后，觀察菌落的形狀、邊緣、隆起形狀和透明度等表型特征。

對分離純化后的菌株分別進行革蘭氏染色和鏡檢。取菌株分別接種于腸桿菌科細菌生化鑒定管（購自杭州微生物試劑有限公司）中，按照說明書操作，并對結果進行初步判定。

2.2.2 分子生物學鑒定

使用16SrRNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR 擴增，PCR 反應體系為25.0 μL：正、反引物各1.0 μL，PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板1.0 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，34 個循環；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保溫。同時，使用無菌水作為陰性對照，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序后分離菌株的16S rRNA 基因序列通過BLAST 程序比對，并通過MEGA 11.0.11 軟件對序列進行分析及構建進化樹。根據形態學和分子生物學鑒定結果，初步判定感染鱷蜥的是檸檬酸桿菌屬和摩氏摩根菌屬細菌，因此依據這2 個菌屬開展后續研究。

recN基因（編碼DNA 修復蛋白）作為檸檬酸桿菌屬的特異標志之一，可以用來準確區分和鑒定檸檬酸桿菌屬的各個菌種［16］。在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載檸檬酸桿菌屬的14種recN基因序列，經比對后，設計引物recN-F（5′-ATTGCVATTGATGCKCTCGG-3′ ），recN-R（5′-AAATCCAGACGATCGCAATA-3′）對分離菌株進行recN基因的PCR 擴增和鑒定。PCR 擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，通過MEGA 11.0.11軟件對序列進行分析及構建進化樹。

使用HiPure Stool DNA Mini Kit 糞便DNA小提試劑盒（上海邁跟生物科技有限公司）提取鱷蜥 腸道內容物的DNA，選取摩氏摩根菌特異性引物Mm208F（5′-CTCGCACCATCAGATGAACCCATAT-3′），Mm1017R（5′-CAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATG-3′）［17］以及檸檬酸桿菌屬特異引物recN-F和recN-R 對鱷蜥的腸道內容物進行PCR 擴增，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR 擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2.3 藥敏試驗

采用紙片擴散（K-B）法對分離菌株進行12種抗菌藥物敏感性試驗，依據美國臨床實驗室標準機構（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）藥敏試驗執行標準［18］判定菌株對抗生素的敏感性。

2.4 多位點序列分型（MLST）

為探究分離菌株的變異情況，按照檸檬酸桿菌屬多位點序列分型方案（https：//pubmlst.org/organ?isms/citrobacter-spp），參考Bai等［19］的研究方法，擴增7 個管家基因（aspC、clpX、fadD、mdh、arcA、dnaG和lysP）后，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

將分離菌株的7 個管家基因序列分別上傳至檸檬酸桿菌屬多位點序列分型數據庫，并與標準菌株比對，分析各等位基因位點的變化情況，形成等位基因譜。選取同源性較高的序列拼接后使用MEGA 11.0.11 軟件中的neighbor-joining（NJ）法構建系統進化樹。

3 結果

3.1 形態學觀察

鱷蜥尸體解剖后見肺充血、腫大，肝腫大，腸壁變薄，腸內脹氣、腫大，腹部含有腹水（圖1）。

圖1 鱷蜥剖檢結果Fig.1 Results of necropsy of Shinisaurus crocodilurus

3.2 菌株分離培養與鑒定

從鱷蜥尸體的肺和肝中各分離得到1 株細菌，分別命名為BL1682F 和BL1682G。兩個分離菌株在普通營養瓊脂培養基中生長狀態良好。BL1682F 呈圓形，中間隆起、表面光滑、半透明、邊緣整齊；BL1682G 呈圓形、中間凸起、表面光滑、濕潤。革蘭氏染色結果均為陰性，桿狀（圖2）。

圖2 分離菌株的革蘭氏染色形態Fig.2 Gram staining morphology of isolated strains

分離菌株的氧化酶試驗均為陰性，生化鑒定結果見表1，查閱產品編碼檢索表，參考《簡明第八版伯杰細菌鑒定手冊》［20］，初步判斷BL1682F為檸檬酸桿菌屬細菌，BL1682G為摩氏摩根菌屬細菌。

表1 分離菌株的生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical properties of isolated strains

3.3 分離菌株的分子生物學鑒定

BL1682F的16S rRNA基因序列與GenBank數據庫中葡萄牙檸檬酸桿菌P10159（CP012554）和弗氏檸檬酸桿菌EnZ-4（MN220573）的一致性均為100.00%，與楊氏檸檬酸桿菌（Citrobacter youngae）L6（CP021963）和布氏檸檬酸桿菌PS 70（KP969055）的一致性均為99.93%；BL1682G 的16S rRNA 基因序列與摩氏摩根菌DG56-16（CP032295）的一致性為99.86%（圖3）。結合16S rRNA 系統進化分析進一步判定BL1682F 為檸檬酸桿菌屬，BL1682G 為摩氏摩根菌屬。

圖3 基于16S rRNA基因序列的NJ系統發育進化樹Fig.3 Neighbor-joining（NJ）tree based on 16S rRNA gene sequences

為進一步確定BL1682F 在檸檬酸桿菌屬中的分類，將BL1682F的recN基因序列與檸檬酸桿菌屬其他的recN基因序列進行比較（表2），發現該菌與葡萄牙檸檬酸桿菌之間的相似性最高，為99.6%，其次是弗氏檸檬酸桿菌，為93.0%。利用recN基因序列構建系統進化樹（圖4），發現BL1682F 與葡萄牙檸檬酸桿菌最接近，這與表2 的結果類似。以上結果說明，分離得到的BL1682F 為葡萄牙檸檬酸桿菌。

表2 檸檬酸桿菌屬不同細菌菌種中的recN相似性比較Tab.2 The comparison of recN gene similarity in different species of bacteria of the genus Citrobacter spp.

圖4 基于recN基因序列的NJ系統發育進化樹Fig.4 Neighbor-joining（NJ）tree based on recN gene sequences

腸道內容物PCR 擴增后的電泳結果表明，2種細菌的條帶大小正確，與陽性樣本一致（圖5），結果證實了死亡鱷蜥腸道內容物中也存在葡萄牙檸檬酸桿菌和摩氏摩根菌。

圖5 患病鱷蜥腸道內容物中摩氏摩根菌和葡萄牙檸檬酸桿菌的檢測結果Fig.5 Detection of Morganella morganii and Citrobacter portucalensis in the intestinal contents of Shinisaurus crocodilurus

3.4 分離菌株的藥敏分析

依據CLSI 藥敏試驗標準鑒定手冊［18］，對2 個分離菌株進行藥敏試驗。結果表明：分離菌株BL1682F 對慶大霉素、阿米卡星、頭孢呋辛、頭孢吡肟、環丙沙星、磺胺甲唑、氨曲南和四環素敏感，對氨芐西林耐藥；分離菌株BL1682G對慶大霉素、哌拉西林、頭孢曲松、頭孢吡肟、磺胺甲唑和氨曲南敏感，對頭孢呋辛和四環素耐藥（表3）。

表3 分離菌株的藥敏試驗結果Tab.3 Results of drug sensitivity tests of isolated strains

3.5 分離菌株BL1682F 的MLST 分型結果及系統發育分析

將分離菌株BL1682F 的7 個管家基因序列上傳至檸檬酸桿菌多位點序列分型數據庫中進行比對分析，結果顯示分離菌株未完全匹配數據庫中的標準菌株。根據比對結果，選取同源性較高的11 株檸檬酸桿菌構建系統進化樹，與BL1682F 親緣關系最近的是ST-4 和ST-267，其次是ST-260（圖6），均有3個等位基因數值匹配，而BL1682F 與其他8 株ST 型僅有2個等位基因數值匹配（表4）。

表4 BL1682F與標準菌株的多位點序列分型Tab.4 Multi-site sequence typing of BL1682F and standard strains

圖6 BL1682F與標準檸檬酸桿菌菌株序列的系統進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of sequences of BL1682F and Citrobacter strains

4 討論

在細菌基因組中，16S rRNA 基因普遍存在，其功能穩定，且高度保守，不易發生水平基因轉移，已成為細菌分類鑒定的重要分子標記［21］。毛爍君等［22］在患病中華鱉（Pelodiscus sinensis）的肝和腹水中分離到1 株細菌，經16S rRNA 測序鑒定為弗氏檸檬酸桿菌。楊星等［23］通過16S rRNA 基因測序，在患病瀕死大鯢肝中分離到1 株細菌，最終鑒定為類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）。本研究中，從死亡鱷蜥肝中分離得到的菌株BL1682G，經16S rRNA 測序鑒定為摩氏摩根菌。然而，16S rRNA 測序方法在區分多態性和相似性較高的菌種時具有一定的局限性。檸檬酸桿菌屬細菌的16S rRNA 基因序列具有很強的多態性，因此僅用16S rRNA 基因來鑒定檸檬酸桿菌屬具體菌種的目標是不準確的。在本研究中，使用16S rRNA 對鱷蜥肺中分離的BL1682F 菌株擴增，經BLAST比對，發現與GenBank數據庫中檸檬酸桿菌屬中的弗氏檸檬酸桿菌、布氏檸檬酸桿菌和葡萄牙檸檬酸桿菌等均具有很高的相似性。有研究表明，檸檬酸桿菌屬的各個菌種可由recN基因準確區分［16］。因此，本研究采用16S rRNA和recN基因來共同鑒定分離菌株，結果表明，從鱷蜥肺中分離的BL1682F菌株為葡萄牙檸檬酸桿菌。

為了確定有效的抗生素，對鱷蜥肺中分離的葡萄牙檸檬酸桿菌進行藥物敏感性測試，結果顯示葡萄牙檸檬酸桿菌對慶大霉素、阿米卡星、頭孢呋辛、頭孢吡肟、環丙沙星、磺胺甲唑、氨曲南和四環素敏感，對氨芐西林耐藥。而在星點水龜體內分離出的葡萄牙檸檬酸桿菌具有廣泛的耐藥型，其對慶大霉素、四環素、多西環素、卡那霉素、鏈霉素、妥布霉素、新生霉素、紅霉素和青霉素表現出耐藥，對新霉素表現為敏感［12］。此外，鱷蜥肝中分離的摩氏摩根菌對慶大霉素、哌拉西林、頭孢曲松、頭孢吡肟、磺胺甲唑和氨曲南敏感，對頭孢呋辛和四環素耐藥。李瑞偉等［14］研究發現，從患病大鯢肝中分離到的摩氏摩根菌對哌拉西林、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南和四環素敏感，對頭孢呋辛和氨芐西林耐藥。尹夢雅［24］從患病中華鱉體內分離到的摩氏摩根菌對頭孢曲松敏感，對慶大霉素、四環素、亞胺培南、環丙沙星和氨芐西林耐藥。以上結果表明，對于同一種細菌，不同來源菌株的藥物敏感性結果產生的差異，可能與環境因素和菌株本身有關。從鱷蜥肺和肝中分別分離的葡萄牙檸檬酸桿菌和摩氏摩根菌對抗生素不存在較強的耐藥性，表明鱷蜥目前的生存環境受抗生素污染的可能性較小。

多位點序列分型是一種基于比較分離菌株與數據庫中標準菌株管家基因的核酸序列來測定分離菌株基因型的方法，該方法已廣泛用于細菌的分子流行病學研究［25］。本研究結果表明，從鱷蜥肺中分離的葡萄牙檸檬酸桿菌BL1682F 為新的序列型（ST），管家基因發生了變異，此管家基因序列與MLST 數據庫中不存在相應的等位基因編號。因此，證明BL1682F 為新型菌株，目前無法從現有數據庫中找到其流行病學規律。為了深入探究葡萄牙檸檬酸桿菌的遺傳進化規律和跨物種間的致病機理，后續研究應對不同來源動物的葡萄牙檸檬酸桿菌進行耐藥及毒力等相關特殊基因型匯總分析。