華南虎染色體核型分析及帶型模式建立研究

龔志海，朱利永，任小冬 ，饒偉強，雷勝橋，吳莉莉，劉力軍，張燕，李秋明，陳斌，謝和平

（1.廣東粵北華南虎省級自然保護區管理處，韶關，512023；2.廣東省嶺南院勘察設計有限公司，廣州，510500；3.杭州艾迪康醫學檢驗中心有限公司，杭州，310030）

華南虎（Panthera tigris amoyensis）是我國特有的虎亞種，野外已多年未發現蹤跡。我國在20 世紀五六十年代，先后從野外捕獲到18 頭華南虎，但僅6 頭（2，4♀）有繁殖記錄。全國各地圈養的華南虎都是這6 頭繁殖的后代［1］。目前國內圈養的華南虎種群是一個高度近親的種群，遺傳多樣性大大降低，種群生育率和幼崽成活率均較低。染色體作為生物遺傳物質，是染色質在細胞分裂中期的特殊形態，是生物細胞遺傳學的主要研究對象。染色體顯帶反映了調節DNA 復制、修復、轉錄和遺傳重組的基因組功能結構。核型分析可用于探討物種親緣關系與進化、遠緣雜種的鑒定以及遺傳病的機制［2］，是評估染色體畸變的一種常規有效方法［3?4］，與熒光原位雜交、單核苷酸多態性陣列和基因組測序等其他更敏感的技術相比，核型分析的分辨率較低［4?5］。

華南虎作為瀕危物種，在核型分析方面研究較少。張錫然等［6?7］對華南虎染色體核型進行了分組，報道了染色體臂比值等數據，并對東北虎（P.t.altaica）和華南虎染色體進行了比較，但對華南虎染色體帶型的研究并不深入。本研究針對華南虎染色體核型和帶型做進一步研究，利用G 帶技術分析華南虎染色體核型及帶型，初步建立華南虎染色體G 帶核型模式圖，以期充實華南虎染色體研究的基礎資料，為虎亞種分類提供遺傳學證據，同時為進一步研究華南虎種群遺傳基因提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

以華南虎繁育研究基地的飼養華南虎外周血為研究對象。將成年虎麻醉保定（舒泰0.02 mg/kg+多咪靜0.02 mL/kg），幼虎人工保定，從后肢或尾部采集外周血液樣本。將外周血樣置于肝素鈉抗凝真空采血管（山東康利萊醫療器材有限公司）內，輕輕顛倒混勻數次，使抗凝劑與血樣充分接觸、溶解，防止凝固。在2020—2022 年，共采集8 只虎（6，2♀）的血樣。

外周血樣在運輸過程中避免劇烈晃動，在極 熱或極寒條件下保溫運輸。血樣在48 h 內接種，當日無法接種或已接種后的標本可置于冰箱4 ℃保存。

1.2 染色體標本制備與培養

各取0.4 mL肝素鈉抗凝外周血平行接種于2瓶淋巴細胞培養液（廣州白云山拜迪生物醫藥有限公司）中，混勻后置二氧化碳培養箱（THERMO ELECTRON HEPA CLASS 100）37 ℃培養72 h。加入40 μg/mL 秋水仙素20 μL，作用80 min 后收獲淋巴細胞，收獲步驟：（1）將培養細胞轉移至15 mL 離心管中，1 500 r/min，離心10 min，去上清，加入0.075 mol/L KCl 低滲，37 ℃水浴，1 500 r/min，離心10 min，去上清，細胞預固定，即直接在低滲后的細胞懸液中緩慢加入2 mL新鮮配制的固定液［V（甲醇）∶V（冰醋酸）=3∶1］，輕輕混勻細胞，吹氣法吹打4～9次后，1 500 r/min，離心10 min 后傾去上清。（2）細胞固定，即加入固定液8 mL，用吹氣法輕輕吹打細胞數次，直至細胞完全分散，蓋上蓋子，室溫下靜置30 min，離心機1 500 r/min，室溫下離心10 min，去上清。（3）再次細胞固定，重復（2）步驟。吸取固定好的細胞懸液均勻滴于冰玻片上（5 或6 滴），過火，80 ℃烤片1 h，胰酶G 帶處理，Giemsa 染色。顯微鏡（OLYMPUS CX41）低倍鏡下尋找良好分裂相，高倍油鏡下觀察形態清晰、分散良好和背景干凈的染色體中期分裂相，并顯微攝影。

1.3 核型分析方法

每例染色體標本至少選取20 個分散適宜、染色深淺適宜和顯帶清晰的中期分裂相計數，并至少分析5 個分裂相。若發現有嵌合可能，則增加計數至50 個分裂相。利用染色體核型分析系統（以色列ASI）拍片、存檔。依據《ISCN》（人類細胞遺傳學國際命名體制）對染色體核型進行分析診斷。

2 結果

2.1 染色體數

鏡檢80 個華南虎淋巴細胞的染色體中期分裂相，發現細胞染色體數少于38 條的比例為6.25%，染色體數為38 條的比例為93.75%，染色體數大于38條的比例為0。絕大多數（93.75%）淋巴細胞的染色體數為38 條，因此，華南虎外周血細胞染色體數為2n=38條（n=19）（圖1）。

圖1 華南虎染色體中期分裂相Fig.1 Metaphase division phase of chromosomes in south China tiger

2.2 染色體核型

選取20 個有絲分裂中期分裂相良好、邊緣清晰的染色體，測量長臂、短臂和著絲粒，計算相對長度、臂比值及著絲粒指數，依照染色體大小遞減排列，將常染色體依次編號為1～18，性染色體不編號，分別以X和Y排列在最后。

根據著絲粒位置分類方法［8］，華南虎18 個常染色體中，2、5、13、18 號染色體為中部著絲粒染色體（m）；1、4、7、8、9、10、11、12、14、17 號染色體為亞中部著絲粒染色體（Sm）；3、6 號染色體為亞端著絲粒染色體（St）；15、16 號染色體為端著絲粒染色體（t）。性染色體X 為1條較大的中部著絲粒染色體（m），性染色體Y 為所有染色體中最短的1 條亞中部著絲粒染色體（Sm）（表1）。核型公式為8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XY（m，Sm）/XX（m，m）。雄、雌華南虎染色體鏡檢見圖2。

表1 華南虎染色體特征Tab.1 Chromosome characteristics of south China tiger

圖2 雄（A）、雌（B）華南虎染色體鏡檢結果Fig.2 Chromosomal microscopy of male（A）and female（B）south China tiger

2.3 染色體G帶帶型模式

從染色體G 帶帶型看，華南虎同源染色體帶紋基本一致，帶紋在每一對染色體上的數目和分布具有明顯的特征。不同長度染色體具有不同的帶紋，一般染色體長度越長帶紋越多（圖3）。常染色體中帶紋最多的是1 號染色體，G 帶數為24 條帶；帶紋最少的是18號染色體，G帶數為6條帶。X染色體長度介于9 號和10 號染色體之間，G 帶數為12 條帶。Y染色體是所有染色體中最短的染色體，G 帶數僅為 3條帶（圖4）。

圖3 華南虎染色體G帶Fig.3 Chromosome G-banding of south China tiger

圖4 華南虎染色體G帶核型模式圖譜Fig.4 G-banding karyotype pattern map of south China tiger

3 討論

3.1 樣本采集、細胞培養及染色體制備

染色體的相關研究一般采用腎組織培養的方法，該方法成功率較高、效果較好，但對于華南虎等兇猛且瀕危的哺乳動物來說卻存在較大風險，采樣難度大。本研究選取華南虎的外周血液樣本作為研究對象，雖降低了采樣難度，但較難進行重復采樣，因此，在細胞培養時規范操作，按規定的試驗步驟提高試驗成功率。

華南虎外周血淋巴細胞培養是染色體標本制備成功的關鍵步驟。將血樣接種至淋巴細胞培養液后放進培養箱中培養，使淋巴細胞從G0 進入細胞周期，開始DNA 復制，當淋巴細胞處于分裂中期時，是進行核型分析和染色體研究的最佳時期。秋水仙堿能破壞并阻止形成細胞的紡錘體，使分裂的細胞停留在分裂中期，此外，秋水仙堿還可使染色體收縮，使染色體形成清晰的輪廓［9］。低滲處理可使細胞腫脹，有利于染色體的分散，空氣干燥可使細胞和染色體展平。由于染色體標本制作過程較長，包括細胞培養、秋水仙素處理、低滲、固定、制片、消化和顯帶等步驟，中間還涉及反復混勻、離心，因此，培養基的成分、pH 值、固定效果、離心和混勻的力度等都是影響染色體標本制備成功的重要因素［10］。此外，試驗材料、秋水仙素濃度、處理時間、低滲溶液種類和滴片時溫差等均可對染色體的實際長度、相對長度及臂比值產生影響［11］。所以，還需要更多試驗研究來豐富華南虎染色體核型帶型方面的內容。細胞學的核型分析資料作為分類學的證據，結合形態學、解剖學、胚胎學和遺傳學等方面的證據，在解決物種分類的疑難問題上發揮不少作用，而且是建立生物學物種和新的自然分類系統所必不可少的資料［12］。因此，華南虎染色體核型帶型研究十分必要。

3.2 染色體核型分析

華南虎染色體組內各條染色體的長度不一致，絕對長度可通過顯微鏡測量，也可采用放大照片測量后換算得出。由于染色體制片過程中使用的藥劑和方法不同，以及標本固定供觀察時細胞分裂不可能保證在同一時期，故染色體的收縮會有所差異而導致染色體絕對長度在同一物種或個體的不同細胞間產生差異，針對這種情況，在分析中常以相對長度作為度量染色體長度的標準。相對長度排除了因技術原因引起的染色體收縮程度不同所產生的差異，因此，相對長度值是一個較穩定的可比較的數值。染色體以相對長度從長至短排序編號，將性染色體單獨列出，進而能更好地與同類相關研究進行比較。染色體的臂比和著絲粒指數也是染色體的重要特征，反映著絲粒的相對位置。在核型測量過程中可能存在一定的測量誤差，要對華南虎染色體進行精確研究，可利用染色體顯帶或熒光原位雜交等技術，提高同源染色體配對的準確性，從而更精確地分析華南虎的核型特征。

張錫然等［6?7］研究表明，華南虎染色體數為38條，其中包含1 對性染色體，與本研究結果一致，但因采用的計算和排序方法不同，使核型分組結果與本研究結果無法直接比較。從華南虎染色體分組來看，本研究結果與張錫然等［6?7］研究存在明顯區別，其認為華南虎染色體應分為5 組，即A 組6 對（Sm），B 組6 對（m），C 組3 對（St），D 組2 對（t），E 組1 對（m），XY 性染色體皆為中著絲粒染色體，而本研究得到的華南虎染色體核型公式為8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XY（m，Sm）/XX（m，m），造成這種差異的原因有待進一步研究。另外，張錫然等［6?7］研究中通過銀染發現18 號染色體存在次縊痕，而本研究因僅進行G 帶核型分析，所以未發現存在次縊痕的染色體，該情況也需要進一步研究才能得出結論。

與鄭維平等［13］研究的東北虎染色體核型特征數據進行比對，發現華南虎與東北虎雖然都是38 條染色體，但多條染色體存在差異，如華南虎4 號、7 號、11 號和Y 染色體臂比值分別為（2.521±0.262）、（2.525±0.263）、（2.357±0.245）和（2.982±0.308），而東北虎4 號、7 號、11 號和Y 染色體臂比值分別為（1.063±0.092）、（1.545±0.071）、（1.500±0.063）和（1.000±0.022），對比以上數據可知，華南虎與東北虎在染色體形態上具備足夠的差異，在動物分類學上可將染色體核型作為虎亞種判定的一種依據。

3.3 G帶帶型分析

華南虎染色體每個分裂相中同源染色體帶紋基本相同，按照帶紋的特征能將同源染色體準確配對，G 帶的研究結果顯示雄性華南虎的核型公式為2n=38=8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XY（m，Sm），雌性華南虎的核型公式為2n=38=8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XX（m，m）。在G 帶分析前僅按照染色體相對長度和臂比值進行分組排序存在誤差的可能性較大，如本研究中華南虎7 號和8 號染色體的相對長度和臂比值非常接近，在類似常規染色體核型中難以區別。因此，使用吉姆薩干性混合物作為染色試劑，可在染色體上產生某種特定的帶型模式，這種G 帶技術方法有利于染色體的分組和排列。因此，在考察G 帶數時，通常不能簡單地分析分帶的數目，而應分析分帶的分布趨勢以及穩定性，特別是以某些深色區帶或非著色區位置作為鑒定的依據［14］。研究發現華南虎G 帶帶型特征及數目與顯帶處理條件有密切關系，對開展貓科（Felidae）動物細胞遺傳學特性、染色體基因定位及染色體多態性改變的研究有重要意義。染色體的帶分布于臂的不同區，在識別染色體時，這些連續和明顯的形態學特征具有重要意義。

目前，國內關于華南虎染色體研究的文獻資料極少，因此，本研究中華南虎染色體核型模式圖譜僅為初步研究結果，華南虎的核型及部分帶型與張錫然等［7］的相關研究存在差異還有待進一步深入研究。

4 結論

通過G 帶技術對華南虎染色體進行核型及帶型分析，初步建立華南虎染色體G 帶核型模式圖，得出結論：（1）華南虎的二倍體染色體數為2n=38 條，其中常染色體18 對，性染色體1 對。（2）核型公式為8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XY（m，Sm）/XX（m，m）。（3）經比對發現，華南虎與東北虎染色體核型存在明顯差異。研究結果能為華南虎的細胞遺傳學研究提供更為詳實的基礎資料，促進華南虎物種保護事業的發展。