藍孔雀腸道菌群中整合子及其水平轉移相關性

陶芬，張饒，廖琦，李芬仙，劉壘成，姜玉莎，苗睿，吳培福

（1.西南林業大學生命科學學院，昆明，650224；2.云南野生動物園，昆明，650225）

在過去的幾十年里，抗生素廣泛應用于畜牧業和養殖業的疾病預防、治療與促進生長，隨著經濟和社會的進步，人們對抗生素的耐藥性也越來越重視。細菌耐藥性的傳播在很大程度上是由水平基因轉移引起的，耐藥基因常通過某些遺傳元件（如質粒、轉座子）傳遞。整合子能夠捕獲并表達外源基因，可將耐藥基因整合到移動元件中，在耐藥基因的轉移過程中發揮重要作用，是衡量耐藥基因水平轉移的一項重要指標。抗生素的使用對人和動物腸道微生物群的組成有很大影響，越來越多的學者［1?2］關注腸道微生物群這一天然的耐藥基因庫、水平基因轉移樞紐［3］，為細菌耐藥性的發展提供了一個良好的平臺，故腸道菌群中整合子及基因盒攜帶情況的分析在水平基因轉移中具有重大意義。

藍孔雀（Pavo cristatus）是一種極具觀賞性的鳥類，目前國內關于藍孔雀疾病的研究主要集中在寄生蟲方面，包括球蟲病［4?5］、絳蟲病、線蟲病和組織滴蟲病［6］，尚未見關于藍孔雀整合子、基因盒的相關分析報道。動物園作為科普宣傳基地，具有物種繁多、人員復雜和流動性大等特點，其細菌耐藥性的防控對公共衛生安全具有重大意義。本研究以動物園藍孔雀糞便為材料，提取菌群基因組DNA，檢測臨床分離株中常見整合子、基因盒的流行情況，并對其進行水平轉移分析，以期為細菌耐藥基因水平轉移研究和藍孔雀疾病防治提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

以昆明市2 個動物園的藍孔雀糞便為研究樣品，其中1～120 號采集于云南野生動物園（相應的基因盒編號為H1～H120），121～139 號采集于圓通山動物園，共計139 份樣品。樣品采集原則：（1）被采樣藍孔雀近期未使用抗生素。（2）在早晨清理藍孔雀糞便前采集新鮮糞便，保證樣品無明顯的雜質污染。（3）盡量無菌采集，用高壓滅菌的50 mL 離心管收集樣品，1 個樣品裝1 個離心管。（4）原則上采集不同藍孔雀個體糞便，但動物園藍孔雀為散養模式，無法做到糞便與個體的統一定位，故采用分散樣地采樣法，即在藍孔雀活動的不同區域內采集，在一定程度上避免同一個體重復采樣。（5）采集成形的、代表藍孔雀個體的糞便，不采集混合糞便。（6）樣品采集后即時送回實驗室，?20 ℃保存備用。在同一時間段采集2 個動物園的藍孔雀糞便樣品，在采樣期間，由于圓通山動物園中游客量較大，導致藍孔雀糞便被反復踩踏，且數量較少，遵循采樣原則，僅采集到19 份樣品。

1.2 宏基因組提取

參考已有研究方法［7?9］，采用蛋白酶K-CTAB-酚氯仿法提取樣品中菌群宏基因組DNA。提取過程：用丙酮、PBS 緩沖液預處理樣品，采用差速離心法去除樣品中的雜質，吸取懸浮液，離心后收集沉淀，用蛋白酶K 和溶菌酶消化細菌，最后采用酚氯仿法純化DNA。

1.3 整合子檢測

引物參考Su等［10］研究，由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）。總反應體系25.0 μL，其中上 游引物（10 μmol/L）1.0 μL，下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，Taq酶1.0 μL，10×TaqBuffer 2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.0 μL，模板DNA 2.0 μL，牛血清白蛋白（BSA）0.1 μL，ddH2O 為15.4 μL。3 類整合子（I類、Ⅱ類和Ⅲ類，即intI1、intI2和intI3）反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環；72 ℃終延伸6 min。Ⅰ類整合子基因盒擴增反應程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環；72 ℃終延伸6 min。配置1%瓊脂糖凝膠，吸取5 μL PCR 產物加入凝膠孔內，在電泳儀（120 V）上電泳30 min。觀察PCR 產物大小，統計擴增結果。

表1 用于擴增3類整合子的引物Tab.1 The primers used in amplifying three types of integrons

1.4 PCR產物測序分析

根據擴增產物的大小，分別選取整合子及基因盒的PCR 產物，送往上海捷瑞生物工程有限公司測序，每類整合子各選取2 個樣本PCR 產物。研究發現，Ⅱ類和Ⅲ類攜帶的基因盒較少，且有的基因盒較大，普通實驗條件無法擴增，Ⅰ類整合子基因盒有多種不同大小的PCR 擴增片段，最小片段約為400 bp，最大片段約為2 900 bp，考慮到蛋白編碼基因和耐藥基因的平均大小，僅研究750 bp及以上的擴增片段，并對電泳中較亮的片段進行測序。小片段可能為空整合子，空整合子一般不攜帶耐藥基因，但存在再次整合可移動耐藥基因的可能性。

下載NCBI 數據庫中的細菌基因組數據及其注釋，比對所測序列和數據庫細菌基因組，找出含95%以上相似性片段的細菌基因組，查看相似片段上、下游5 kb側翼區序列，如有整合酶/重組酶、轉座子等關鍵基因，則可認為該基因盒具有水平轉移的可能性。

1.5 統計與分析

用Excel 2016 整理和統計數據，Chromas 軟件查看測序結果。仔細比對上、下游引物，選取測序結果一致的序列片段，利用NCBI數據庫中BLAST程序搜索分析測序片段的同源性，并用Excel 2016、AI 軟件和R軟件包進行相應的繪圖分析。

2 結果

2.1 整合子流行特征

所有樣品中，intI1、intI2和intI3檢出率分別為86.33%、69.78%和11.51%。圖1 展示了云南野生動物園和圓通山動物園樣品中整合子流行分布特征，intI1和intI2具有相似的分布特征，而intI3在2個動物園間存在差異（圓通山動物園樣品中未發現intI3）。

圖1 3類整合子的分布特征Fig.1 The distribution patterns of three types of integrons

2.2 樣品基因盒擴增特征

從樣品中擴增出不同大小或類別的Ⅰ類整合子基因盒條帶，考慮到基因平均大小，只統計750 bp以上的條帶類型（其余小片段見表2）。擴增的條帶共有18種，片段大小為750～2 900 bp。每個樣品的擴增條帶數共有7種類型（圖2 左上角），共發現51種不同大小條帶的組合模式（圖2）。從樣品來源看，云南野生動物園與圓通山動物園樣品基因盒擴增模式無明顯區別，即圓通山動物園樣品組合模式分散于云南野生動物園的樣品中，但2 條最大擴增條帶 2 900 bp均來自圓通山動物園的樣品中。

表2 Ⅰ類整合子小片段基因盒統計Tab.2 Statistics of integron Ⅰ small fragment gene cassettes

圖2 樣品基因盒的擴增模式Fig.2 The PCR patterns of sample integrons

2.3 Ⅰ類整合子基因盒測序結果

從Ⅰ類整合子基因盒的擴增結果中隨機選取條帶較亮且引物二聚體較少的樣品（均為云南野生動物園），即7 個基因盒樣品（H12、H16、H22、H26、H27、H56、H78）進行測序，其中H12和H22樣品基因盒為aadA2基因，H16 和H56 樣品基因盒為aadA1基因，H26 和H27 樣品基因盒為dfrA27基因，H78 樣品基因盒結構分析表明，該基因盒包含aadA2閱讀框、移碼突變的截短基因aac（6'）-Ib片段和arr閱讀框，其中aadA2閱讀框具有與H22一致結構。

在NCBI 數據庫中，序列對比發現，各基因盒序列與腸桿菌科（Enterobacteraceae）的多種細菌質粒和染色體上序列片段有很高的同源性，如大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）和腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）等，這些菌株來自不同的動物宿主、國家與分離樣品。部分基因盒相似序列具有共同的菌株來源，H12、H16 和H56 樣品基因盒具有相似序列，H22 和H78、H26和H27具有相似序列（表3）。

表3 各基因盒的共同相似序列（NCBI比對）Tab.3 The common similarity sequence of each gene cassette（NCBI alignment）

2.4 基因盒水平轉移相關性

雖然在基因盒測序結果中對序列相似性進行了BLAST 比對分析，并在一定程度上反映了樣品基因盒在不同環境、菌種、宿主和國家的分布廣泛性，即整合子基因盒會在不同環境、菌種、宿主和國家間發生傳播，但上述分析結果只展示了部分情況，不能在所有菌門、屬或種的水平上反映基因盒分布偏向性或水平轉移宿主偏向性，也不能反映基因盒在不同宿主、環境和國家分布偏向性。耐藥基因傳播有垂直傳播和水平傳播，水平傳播對人和動物的健康會造成巨大危害，故本研究從染色體基因組、質粒、噬菌體和微生物組角度來分析樣品基因盒與水平轉移的相關性。

2.4.1 基于染色體、質粒基因組的相關性

利用染色體、質粒基因組數據庫進行相關分析，其中染色體基因組有95 175 個，質粒基因組有 34 678 個，經比對分析發現，與H16 和H56 基因盒（aadA1）、H12 和H22 基因盒（aadA2）相似性較高的序列片段主要源自變形菌門（Proteobacteria）（占絕大多數）、藍細菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Acti?nobacteria），但aadA1、aadA2水平轉移主要發生在變形菌 門中；與H26 和H27基因盒（dfrA27）、H78（aadA2、aac（6'）-Ib、arr）相似性較高的序列片段主要源自變形菌門和放線菌門，且該基因水平轉移主要發生在變形菌門的細菌間，也見于放線菌門的細菌間。由此可見，7個基因盒的水平轉移主要發生在變形菌門的細菌中，且具有共同的菌株來源（圖3），其中銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏桿菌、腸沙門氏菌（Salmonella enterica）與所有基因盒間均存在水平轉移相關性，說明了藍孔雀腸道菌群中耐藥基因主要由這幾類細菌傳播。

圖3 基因盒與染色體、質粒基因組的水平轉移相關性Fig.3 Correlation analysis of horizontal transfer of gene cassette in chromosome and plasmid genome

2.4.2 基于微生物、臨床基因組的相關性

在整合微生物基因組數據庫中記錄有154 974個宏基因組數據，經比對分析發現，與環境和工程相關的環境中，共篩選到120 個宏基因組數據；臨床基因組中，共篩選到192 株具有明顯臨床分離株標注特征的基因組數據。由表4 可知，即使是不同來源（環境、臨床）的樣品（基于NCBI 比對）均可進行耐藥基因的傳遞，說明耐藥基因的跨界傳播；在不同宿主細菌中肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏桿菌、腸沙門氏菌和銅綠假單胞菌是各基因組中傳遞耐藥性的主要細菌，充分說明了這些細菌在水平基因轉移中的重要性。

表4 基于環境基因組與臨床基因組的水平轉移相關性Tab.4 Horizontal transfer correlation analysis based on environmental genome and clinical genome

2.4.3 基于噬菌體基因組的相關性

在NCBI 數據庫中，病毒基因組共有11 545 個，其中涉及細菌的噬菌體基因組有4 183個。同上，下載病毒基因組數據，并與測序序列比對，但噬菌體基因組中沒有與本研究序列相似的片段，說明基因盒基因的水平傳播主要借助質粒、整合子和插入元件等可移動元件。

3 討論

3.1 整合子及基因盒流行特征

本研 究中，intI1、intI2和intI3檢出率 分別為86.33%、69.78% 和11.51%，均與各基因流行情況［11］保持一致，但又有所不同。馮濤［12］在狐源大腸桿菌分離株中得到的intI1和intI2檢出率分別為62.77%和13.56%，intI3未檢出；王東陽等［13］對貉源大腸桿菌整合子進行檢測，發現intI1檢出率為72.00%，intI2為9.33%，未檢出intI3，而本研究中3類整合子基因檢出率都較高。在大部分研究中，Ⅱ類整合子常攜帶dfrA1、sat2和aadA1，與Ⅰ類整合子相似；Ⅲ類整合子常攜帶β-內酰胺類和氨基糖苷類耐藥基因，但該型整合子較為少見［14］。本試驗中Ⅱ、Ⅲ類整合子都存在較高的檢出率，一方面說明宏基因組DNA 中檢出率高于單菌株，另一方面說明動物園中藍孔雀種群存在較高耐藥性及耐藥基因轉移可能性。

Ⅰ類整合子是廣泛分布于臨床和環境中的細菌遺傳元件，尤其在革蘭氏陰性菌中［15］，細菌的耐藥譜主要受其影響［16?17］，故研究檢測了其攜帶的基因盒。結果顯示基因盒主要為氨基糖苷類和甲氧芐啶類耐藥基因，這2 類基因盒常在分離株中被檢測到［18］。Ⅰ類整合子基因盒組合形式有較高的多樣性［19?20］，在本研究中主要表現為不同長度條帶組合的多種譜型，組合形式共計51種，反應了藍孔雀種群潛在多重耐藥的復雜性。

3.2 樣品基因盒結構特征及水平轉移特性

本研究中，基因盒的測序分析發現7 個樣品均攜帶與水平轉移相關的基因，且具有完整的基因結構（兩端保守區域及中間可變區），因此，這些基因盒具有水平轉移的可能性。目前，有研究表征細菌中Ⅰ類整合子攜帶基因盒進行水平轉移的過程，如陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、沙門氏菌和大腸埃希氏桿菌［11，21?22］，Yu等［11］研究中表征了Ⅰ類整合子攜帶不同類別的基因盒，并驗證了其接合轉移的能力，進一步說明了本研究中基因盒水平轉移特性，且這些基因水平轉移主要發生在變形菌門中，這與大多數研究結果保持一致，如Zhao等［23］研究顯示CTX-M等位基因通過水平轉移在臨床大腸埃希氏桿菌和克雷伯氏菌中廣泛傳播，Zheng等［24］將臨床分離株中具ESBL基因（blaOXA-48、blaNDM-1、blaKPC-2和blaSHV-1）的質粒成功轉移到實驗室大腸埃希氏桿菌中。

在不同基因組數據中，7個樣品基因盒具有相似（>95%）的來源，包括宿主、菌種、分離株和國家，說明耐藥基因水平轉移的普遍性及全球性，這些片段均具備水平基因轉移特征（具整合酶、完整的基因結構等），基因盒可在動物、人與環境之間傳播，與霍瑋［25］的研究結果保持一致，霍瑋在動物園靈長類（Primates）動物活動區域與飼養員體內均發現了攜帶mcr-1基因的大腸埃希氏桿菌分離株（但未證實來源是飼養員還是環境）。另外，基因盒相似片段的來源覆蓋世界各地，耐藥基因水平轉移具全球性［26］，基因盒主要通過質粒傳播，耐藥性轉移具廣泛性，其宿主細菌主要有肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏桿菌、腸沙門氏菌和銅綠假單胞菌等，這些細菌也是臨床檢測中出現最多的病原菌，表明這些細菌是耐藥基因的重要來源。

3.3 腸道菌群中宏基因組DNA研究

試驗通常通過培養的方法擴增單菌株中的耐藥基因，然而約有80%腸道微生物是無法培養的。本研究方法與傳統培養方法相比，具有更高的檢測靈敏度，可檢測到更多非活菌中的耐藥基因，故直接采用PCR 檢測，結果會比培養之后的檢出率更高，這在本研究Ⅱ類、Ⅲ類整合子檢出率上得到體現。

綜上，Ⅰ類整合子流行性較高，攜帶有不同大小條帶的基因盒，并具水平轉移能力，動物腸道中有密集的微生物群，發生水平基因轉移的可能性比預期還會更高，說明耐藥基因傳播的高風險性。此外，外界環境在耐藥基因的發展和傳播中起很大作用［27］，本研究中，與樣品序列相似性高的來源也包括環境，環境是耐藥基因的一個重要儲存場所。