基于實驗猴國家標準對野外救護猴病毒血清學檢測分析

李世宗 ，李艷艷 ，金志堃，李中員，楊鳳梅，靳瑋華，唐潔，陳麗雄，劉權，孫文亭，鄧自君，趙遠，和占龍

（1.云南森林自然中心，昆明，650224；2.中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所，國家非人靈長類實驗動物資源庫，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，昆明，650118；3.西雙版納州野生動植物保護管理站，景洪，666100）

野生動物收容救護是加強野生動物保護管理中重要的一項工作內容，通過收容、治療、康復護理和野化訓練等方法，讓被救護動物健康回歸原野生環境，或對它們進行遷地保護，使受威脅的野生動物生命得到最大限度地延續，控制疫病傳播，促進野生動物的科學研究及與其相關的科普教育［1］。

我國的非人靈長類有懶猴科（Lorisidae）、猴科（Cercopithecidae）和長臂猿科（Hylobatidae）3 個科，猴科獼猴屬（Macaca）是現在靈長類組成的主體，目前共有8 個種，即短尾猴（M.arctoides）、熊猴（M.as?samensis）、臺灣獼猴（M.cyclopis）、北豚尾猴（M.leo?nina）、白頰獼猴（M.leucogenys）、獼猴（M.mulatta）、達旺猴（M.munzala）和藏酋猴（M.thibetana）［2］。我國所有3個科的靈長類在云南都有分布［3?4］。

以獼猴和食蟹猴（M.fascicularis）為代表的靈長類動物在親緣關系上最接近人類，遺傳物質同源性達75.0%～98.5%［5］，在組織結構、免疫、生理和代謝等方面與人類高度相似，因此成為探索生命及健康的重大基礎科學問題和生物醫藥臨床轉化應用等領域中的關鍵戰略資源，同時作為嚴格意義的實驗動物已經建立了相關國家標準對其飼養繁育、質量監測和疾病防控進行管理。

實驗猴微生物學等級國家標準中要求SPF 級實驗猴獼猴皰疹病毒Ⅰ型（Cercopithecine herpesvirus type Ⅰ，BV）、猴T 細胞趨向性病毒Ⅰ型（Simian T lymphotropic virus type 1，STLV-1）、猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）、猴逆轉D 型病毒（Simian retrovirus D，SRV）和猴痘病毒（Simian pox virus，SPV）為陰性。若感染以上病毒，將會影響動物的健康和質量。本研究基于實驗猴國家標準對野外救護猴開展5 項病毒血清學檢測，為野生非人靈長類動物實驗動物化提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 動物及樣本來源

試驗動物為獼猴、北豚尾猴、熊猴和短尾猴，均來源于云南省野生動植物救護繁育中心和云南省西雙版納州野生動物收容救護中心，將采集處理的 94份血清樣本（獼猴34份、北豚尾猴13份、熊猴43份和短尾猴4份）作為試驗材料。

1.2 試驗試劑及儀器

猴B病毒酶聯免疫抗體檢測試劑盒（BV，IgG，批號E21110501）、猴T 淋巴細胞趨向性病毒酶聯免疫抗體檢測試劑盒（STLV-1，IgG，批號E22031402）、猴免疫缺陷病毒酶聯免疫抗體檢測試劑盒（SIV，IgG，批號E22031403）、猴逆轉D 型病毒酶聯免疫抗體檢測試劑盒（SRV，IgG，批號E22031401）和猴痘病毒酶聯免疫抗體檢測試劑盒（SPV，IgG，批號E22080901）均購自蘇州西山生物技術有限公司。

試驗儀器主要有全波長多功能酶標儀（BioTek），Microfuge 20R臺式高速冷凍離心機（Thermo）等。

1.3 樣本處理

采集血液樣本的工作人員在采集過程中穿戴防護用品，做好個人防護。動物麻醉保定后采用一次性采血針采集后肢靜脈血，血液置于含有分離膠的采血管中，密閉包裝后低溫冷藏運輸（切忌震蕩與搖晃）。樣本3 000 r/min，離心10 min，分離血清。

1.4 抗體檢測

依據GB 14922.2—2011《實驗動物 微生物學等級及監測》中SPF 級猴病毒學檢測指標，利用酶聯免疫吸附法檢測血清BV、STLV-1、SIV、SRV 和SPV 抗體水平。具體操作按照試劑盒說明進行。

1.5 數據分析

檢測結果按照野生猴年齡、物種及性別進行比較，計算抗體陽性率及混合感染率［6］，其中檢測陽性率=檢測出抗體陽性的猴數（只）/猴總數（只）×100%，混合感染率=檢測出2種及以上抗體陽性的猴數（只）/檢出猴總數（只）×100%。

利用GraphPad Prism 8 軟件的Fisher 確切概率檢驗法對抗體陽性率的差異性進行比較和分析［7］，顯著水平α=0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 BV抗體檢測結果

對熊猴、北豚尾猴、獼猴和短尾猴血清BV 抗體陽性率進行計算及分析，結果如表1。BV 抗體陽性率為15.96%；雌性熊猴陽性率為14.29%，雌雄間無顯著性差異（pTwo-sided=0.107 8，pOne-sided=0.107 8）；雄性和雌性獼猴陽性率分別為22.22%和31.25%，但二者間無顯著性差異（pTwo-sided=0.702 7，pOne-sided=0.417 4）；雄性短尾猴陽性率為75.00%；雌性和雄性北豚尾猴均未檢出BV 抗體。熊猴與獼猴（pTwo-sided=0.026 9，pOne-sided=0.021 2）、熊猴與短尾猴（pTwo-sided=0.004 7，pOne-sided=0.004 7）陽性率具有顯著差異。

表1 BV抗體陽性情況Tab.1 The situation of BV antibody positive

2.2 STLV-1抗體檢測結果

STLV-1 抗體陽性率為1.06%，其中僅有雌性獼猴檢測到STLV-1 抗體，陽性率為6.25%，雄性和雌性獼猴之間無顯著差異（pTwo-sided=0.470 6，pOne-sided=0.470 6）；熊猴、北豚尾猴和短尾猴STLV-1抗體陽性率均為0。4 個物種間相互比較均無顯著性差異（表2）。

表2 STLV-1抗體陽性情況Tab.2 The situation of STLV-1 antibody positive

2.3 SIV抗體檢測結果

經檢測，野生熊猴、北豚尾猴、獼猴和短尾猴SIV抗體均為陰性。

2.4 SRV抗體檢測結果

SRV 抗體陽性率為3.19%，4種野生猴的雄性SRV 抗體均為陰性，雌性熊猴陽性率為4.76%，雌性北豚尾猴陽性率為25.00%，雌雄間無顯著差異（表3）。熊猴和北豚尾猴間無顯著差異（pTwo-sided=0.131 3、pOne-sided=0.131 3）。

表3 SRV抗體陽性情況Tab.3 The situation of SRV antibody positive

2.5 SPV抗體檢測結果

經檢測，野生熊猴、北豚尾猴、獼猴和短尾猴SPV抗體均為陰性。

2.6 混合感染結果

對檢測出2種及以上抗體的動物計算混合感染率，結果顯示，本次檢測的4種野生猴均未見混合感染情況。

2.7 年齡與感染情況

根據野生猴齒式推斷其年齡。按照年齡將野生猴大致分成<5 歲、5～10 歲、>10 歲3 個年齡段。結果顯示，小于5 歲的熊猴未檢出BV 抗體，5～10歲陽性率為7.14%，大于10 歲的陽性率為11.11%；北豚尾猴各年齡段均為陰性；小于5 歲的獼猴BV 抗體陽性率為33.33%，5～10 歲陽性率略有下降，為20.00%，大于10 歲的陽性率為50.00%；5～10 歲短尾猴陽性率為100.00%，大于10 歲的陽性率為66.67%。STLV-1 抗體僅在5～10歲的獼猴中檢出。SRV 抗體僅在熊猴和北豚尾猴中檢出，大于10 歲的熊猴陽性率為11.11%；大于10 歲的北豚尾猴陽性率為25.00%，較5～10 歲的陽性率高（圖1）。

圖1 野生猴年齡與抗體陽性情況Fig.1 The rate of antibody positivity with age in wild monkeys

3 討論

關于靈長類實驗動物研究及應用、不同來源的獼猴（恒河猴）開展多種病毒血清學抗體檢測的報道較多［8?9］，但針對不同物種的野生猴病毒學相關檢測和研究報道相對較少。本研究基于國標中SPF 級實驗猴病毒學指標，對云南省野外救護猴的病毒血清學抗體陽性率及其與性別、物種和年齡的差異性進行比較分析，獲得部分野生猴病毒學方面的相關數據，為野生動物救護治療及野生猴疫源疫病監測提供參考和指導。

BV 是一種嚴重危害人類健康的人獸共患病毒，致死率可達70%以上［10］。BV的自然宿主是獼猴，研究報道有較高的感染率，可達10%～60%［11］。符明泰等［12］對廣西地區獼猴（恒河猴）BV 抗體的調查結果顯示，小群關養猴和野生猴抗體陽性率分別為20.3%和16.6%。安徽省實驗猴中心報道不同性別實驗獼猴BV（B 病毒）抗體陽性率差異不顯著，而不同年齡實驗猴抗體陽性率存在顯著差異，呈隨年齡增長而遞增的趨勢［13］。本研究中，熊猴、北豚尾猴、獼猴和短尾猴4種野生猴BV 抗體陽性率為15.96%，與云南地區野生獼猴陽性率［14］基本一致。短尾猴陽性率最高，為75.00%，可能與動物數量較少，且性別及年齡段單一有關，其次為獼猴、熊猴，而北豚尾猴未攜帶BV抗體。性別間比較，同一物種的野生猴雌雄間不存在顯著性差異。年齡間比較，熊猴陽性率呈現隨年齡增長而增加的趨勢，與蔡標等［13］的研究結果相符；獼猴陽性率在5～10 歲年齡段下降，大于10 歲陽性率回升，這與成年動物生活史較長，接觸生活環境復雜程度有關。物種間比較，熊猴與獼猴具有顯著性差異、熊猴與短尾猴具有顯著性差異，提示病毒感染情況存在種屬間差異。

STLV-1 主要侵害實驗猴免疫系統，引發相關疾病，但多數情況下猴感染后表現為潛伏感染，增加該病毒的隱匿性。國內不同猴場實驗猴STLV-1 感染率差異較大，云南、廣東、海南、河南和廣西各省猴場實驗猴抗體水平比較，云南猴場的感染率最高，達到25%，其次為廣東、海南和河南［8］。另有研究顯示，云南省某人工飼養群中國獼猴（SCXK 滇2008-0001）的SRV、STLV和BV陽性感染率分別為19.71%、13.38%和23.11%［15］。李紹東等［16］對我國西南三省的野捕獼猴（恒河猴）STLV-1 抗體進行檢測，陽性率為8.8%。本研究中僅在1 只獼猴中檢測到STLV-1 抗體，陽性率為2.94%。不同報道中陽性率存在差異可能和動物來源或檢測方法有關。

不同猴種SRV 感染率有明顯差異，Krugner-Higby等［17］用IFA 結合Western blot 的方法調查了食蟹猴、獼猴和短尾猴SRV 陽性率分別為36.1%、3.5%和11.9%。劉洋銓等［9］研究結果也證實了這種差異，獼猴（恒河猴）樣本和繁殖單元陽性率分別為11.64%和35.29%，顯著高于食蟹猴。本研究在熊猴、北豚尾猴、獼猴和短尾猴4種野生猴SRV 抗體的檢測中，發現熊猴、北豚尾猴的陽性率分別為2.33%和15.38%，而獼猴和短尾猴未檢出。各物種野生猴性別間無顯著性差異，4種野生猴種屬間無顯著性差異。熊猴僅在年長動物中檢出，北豚尾猴陽性率隨年齡增長而增加。本結果與以往研究結果相比存在一定差異，可能與檢測方法、動物來源及飼育方式差異有關。

獼猴和食蟹猴均可被某種SIV 亞型感染，表現出與人類感染HIV-1 相似的過程，大多數動物在感染1～4年后會出現致命的類似AIDS的癥狀［18］。SHIV 感染的北豚尾猴（平頂猴）曾被普遍認為是研究HIV/AIDS 的理想模型［19］，平頂猴在感染HIV-1 或其亞型后，體內出現HIV 病毒的復制［20］。也有研究認為中國獼猴感染SIVamc239 后，表現出的病毒復制、發病速率及免疫損傷情況與人感染HIV-1 更為接近［21］。2022 年多國出現了人感染猴痘的病例，5月世界衛生組織發布猴痘病毒疫情暴發預警［22］。常用的非人靈長類的猴痘動物模型為食蟹猴和狨猴（Callithrix jacchus）［23］。在20 世紀90 年代，就有報道稱云南獼猴SPV 感染率為57.14%，四川為35.48%，混合群為57.14%；新捕捉猴為33.30%，籠養為37.50%，群飼為90.12%［14］；周亞敏等［24］的研究顯示云南省野生獼猴（恒河猴）猴痘病毒的抗體陽性率為19.40%，野生猴血清學抗體全陰的結果也有報道［12］。本研究中野生猴群均未檢測到SPV和SIV抗體。

通過對野生猴5 項病毒抗體水平的研究，發現BV 陽性率最高，由于野生猴活動范圍廣，人與野生動物近距離接觸增多，生存活動空間重疊面增大，野生猴與人、與其他野生動物接觸的生活環境更加復雜且存在差異。為了解和掌握野生猴疫源疫病情況，應采取有效、長期的跟蹤監測，加強野生動物疫源疫病和人獸共患疾病的動態跟蹤調查和處置工作，最終保護和促進野生動物和人類健康。