冬季和夏季達烏爾黃鼠下丘腦c-Fos、nNOS和NPY表達及血清激素水平比較

鄭楊慧，王 恒，馬小梅，王建禮

（北方民族大學生物科學與工程學院，國家民委黃河流域農牧交錯區生態保護重點實驗室，銀川，750021）

食欲是中樞和外周信號系統相互作用調節個體對營養攝入的反應［1］。營養物質引起的機械或化學信號可刺激胃腸激素分泌，腸道激素、胰島素和脂肪激素通過血液循環或迷走神經運輸，影響調控食物相關行為的關鍵腦區繼而調節食欲。下丘腦被認為是食欲調節和能量穩定的關鍵結構，其中下丘腦弓狀核（arcuate nucleus，ARC）、下丘腦室旁核（paraven?tricular nucleus，PVN）、下丘腦腹內側核（ventrome?dial hypothalamic nucleus，VMH）、下丘腦外側區（lat?eral hypothalamic area，LHA）以及下丘腦背內側核（dorsomedial hypothalamic nucleus，DMH）合稱為食欲調節中樞［2?5］。ARC 是控制食欲的中心單元，其他參與調節攝食行為的腦區位于ARC 下游［6］。PVN 分泌的促腎上腺激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）和促甲狀腺素釋放激素（thyrotropin releasing hormone，TRH）能夠抑制食物攝入［1，5］；LHA為饑餓或攝食中樞，VMH 為飽食中樞，受到刺激會抑制進食；DMH 與情緒調節有關，也能促進食欲。下丘腦通過整合來自血液循環或迷走神經的代謝、激素和神經元信號，調節神經肽諸如NPY（neuropep?tide Y）、食欲素（orexin，OX）等物質的釋放繼而調節食欲。同時，這些信號在更高級大腦中心被進一步整合，根據能量實時需求，產生進食或節食行為，維持能量攝入或支出平衡［3］。

NPY 是一種很強的促食因子，在機體攝食活動中發揮重要調節作用。當機體處于不同能量需求時，下丘腦NPY 能神經元可以直接調節攝食與消化功能，也可通過胃腸神經系統調節［4］。調節攝食的許多神經肽可通過上調或下調內源性一氧化氮（ni?tric oxide，NO）調節食物攝入量，因此，NO 成為神經肽調節食欲的核心成分［7?8］。由于NO 定位定量較難，可借助于神經元型一氧化氮合酶（neuronal ni?tric oxide synthase，nNOS）作為其生成標記酶。CRH除了在應激反應方面具有重要作用以外，也參與能量代謝，調節食欲［3］，作為一種抗食欲調節因子，CRH 減少將會增加動物攝食行為。胃腸道激素也是食欲調節的重要信使，如胃饑餓素（ghrelin，GHRL）主要產生于胃部，是唯一的腸源性增食激素，具有促進食欲的作用，在調節食欲和能量穩態中扮演了關鍵角色［9］。c-Fos 是一種被廣泛使用的中樞神經系統神經元激活的標志蛋白，對動物攝食也有一定指示作用［10］。研究表明外周和中樞注射GHRL 能提高下丘腦ARC、PVN 及DMH 腦區c-Fos表達［4］。

冬眠是一些動物在冬季出現的非活動狀態，是長期進化過程中適應冬季寒冷和食物短缺等條件的行為與生理策略。達烏爾黃鼠（Spermophilus dauri?cus）是一種典型的貯脂類冬眠動物，在研究冬眠、肥胖及肌萎縮機制等方面被廣泛使用，已成為研究適應極端條件生理機制的天然動物模型［11?14］。達烏爾黃鼠春季靜止代謝率（resting metabolic rate，RMR）最高，秋季次之，夏季最低，冬眠期RMR 降到極低水平，僅為春季3%［15］，體脂量在冬眠前大幅增加，體重增加近1倍［16］。研究阿片肽在達烏爾黃鼠冬眠調控的作用發現，腦中阿片肽含量具有明顯季節差異［17］，說明達烏爾黃鼠生理機能具有季節性適應。動物在冬眠時自發停止進食，能量需求降低，為了探明與食欲相關的神經內分泌因子在動物冬眠期和活動期發生了怎樣的適應性變化，本研究檢測了達烏爾黃鼠冬季（冬眠期）和夏季（活動期）下丘腦核團c-Fos、nNOS 和NPY 表達，同時檢測了血清GHRL 和CRH濃度，以探討中樞和外周信號在食欲調節方面的季節性適應。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

達烏爾黃鼠捕自寧夏鹽池縣惠安堡，分為夏季組（7 月上旬試驗，共15 只）和冬季組（12 月下旬試驗，共11只），皆為雄性成體。夏季組于6月捕獲，冬眠組于冬眠前（10月）捕獲，提供食物和飲水，在室內溫度逐漸降為3～5 ℃，光照變為全黑條件下，達烏爾黃鼠會自發地進入冬眠狀態［18?20］。

1.2 c-Fos、nNOS和NPY免疫組織化學實驗

試驗于09：00—11：00 進行，冬眠組在達烏爾黃鼠處于冬眠時取材，麻醉后開胸暴露心臟，左心室灌注0.01 mol/L PBS 緩沖液約150 mL，再以4%多聚甲醛灌注，取腦組織置于4%多聚甲醛液固定6 h，待腦組織沉底后換至30%蔗糖溶液中，待沉底后取出，做c-Fos、nNOS和NPY免疫組織化學試驗。c-Fos 和nNOS 試驗夏季用8 只達烏爾黃鼠，冬季用6 只，NPY試驗夏季用7只，冬季用5只。

沉底的腦組織用組織包埋劑包埋，并在?24 ℃冷凍切片機上做厚度為30 μm 的冠狀連續切片。用盛有0.01 mol/L PBS 緩沖液培養皿收集切片。將收集好的腦組織切片取出并放入反應槽后，滴加3% H2O2室溫封閉10 min。去除H2O2后，用蒸餾水、0.01 mol/L PBS 緩沖液各洗1 次，每次5 min。滴加5%BSA，37 ℃封閉孵育1 h 后，加入一抗c-Fos（ab190289，1∶5 000，Abcam（香港）有限公司）或nNOS（ab5583，1∶500，Abcam（香港）有限公司）或NPY（ab30914，1∶1 000，Abcam（香港）有限公司），4 ℃孵育72 h。隨后用0.01 mol/L PBS 緩沖液漂洗 5 min×3 次，滴加生物素化羊抗兔IgG（博士德生物 工程有限公司，武漢），37 ℃孵育1.5 h。再用 0.01 mol/L PBS 緩沖液漂洗5 min×3 次，滴加SABC試劑（武漢博士德生物工程有限公司），37 ℃孵育2.5 h，0.01 mol/L PBS 緩沖液漂洗10 min×4 次。用DAB 顯色劑（武漢博士德生物有限公司）顯色，最后使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

各腦區參照Paxinos等［21］的小鼠腦圖譜定位，使用Motic Panthera U 數碼顯微鏡在10×10 倍鏡下觀察、計數和拍照。每只鼠各核區選擇3 張連續切片量化，利用顯微測微尺，計算相同面積內單側腦區核團免疫活性神經元數目，包括下丘腦ARC、PVN、VMH、LHA及DMH腦區。

1.3 血清激素檢測

達烏爾黃鼠麻醉后心臟取血，血液收集于離心管中，4 ℃靜置1 h 后，3 000 r/min 離心15 min，吸取上清液放置在標記好的EP 管中，冰箱?20 ℃保存。購買GHRL（CEA991Ra）和CRH（CEA835Mu）ELISA檢測試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司），按照試劑盒操作說明檢測。由于部分達烏爾黃鼠采血量不足及各激素檢測所需血清量不同，因此實際檢測激素樣本量有所不同（GHRL：夏季n=8，冬季n=8；CRH：夏季n=6，冬季n=6）。

1.4 數據統計分析

所有數據用SPSS 20.0處理，冬季和夏季免疫活性神經元數目及血清激素濃度差異采用獨立樣本t檢驗比較，p<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 c-Fos-IR、nNOS-IR和NPY-IR神經元表達

冬季與夏季相比，c-Fos-IR 神經元密度在ARC（t12=2.863，p<0.05）、PVN（t12=7.455，p<0.001）、VMH（t12=4.266，p<0.01）、LHA（t12=2.424，p<0.05）和DMH（t12=3.232，p<0.05）表達減少（圖1A，圖2）。nNOS-IR 神經元密度在PVN（t12=6.474，p<0.001）、VMH（t12=3.461，p<0.05）、LHA（t12=4.332，p<0.001）和DMH（t12=3.896，p<0.05）顯著減少，但在ARC 表達沒有顯著差異（t12=1.562，p>0.05）（圖1B，圖3）。NPY-IR 神經元在ARC（t10=7.056，p<0.001）和VMH（t10=9.253，p<0.001）表達顯著減少，但在LHA 的NPY-IR 神經元數目顯著高于夏季（t10=5.125，p<0.001）（圖1C，圖4）。

圖1 冬季和夏季達烏爾黃鼠下丘腦c-Fos-IR、nNOS-IR和NPY-IR神經元密度Fig.1 Density of c-Fos-IR，nNOS-IR and NPY-IR neurons in the hypothalamus of Daurian ground squirrels in winter and summer

圖2 冬季和夏季達烏爾黃鼠c-Fos免疫組織化學染色Fig.2 Immunohistochemical localization of hypothalamic c-Fos in Daurian ground squirrels in winter and summer

圖3 冬季和夏季達烏爾黃鼠下丘腦nNOS免疫組織化學染色Fig.3 Immunohistochemical localization of hypothalamic nNOS in Daurian ground squirrels in winter and summer

圖4 冬季和夏季達烏爾黃鼠下丘腦NPY免疫組織化學染色Fig.4 Immunohistochemical localization of hypothalamic NPY in Daurian ground squirrels in winter and summer

2.2 血清GHRL和CRH水平

冬季達烏爾黃鼠血清GHRL 濃度顯著低于夏季（t14=5.295，p<0.001），但CRH 濃度高于夏季（t10=3.558，p<0.01）（圖5）。

圖5 冬季和夏季達烏爾黃鼠血清GHRL和CRH質量濃度Fig.5 Concentrations of serum GHRL and CRH in Daurian ground squirrels in winter and summer

3 討論

c-Fos、nNOS 和NPY 神經元廣泛分布于下丘 腦各區［4，22?23］。本研究結果顯示，達烏爾黃鼠冬季 c-Fos-IR神經元密度在ARC、PVN、VMH、LHA及DMH區域低于夏季活動期；除ARC外，冬季nNOS-IR神經元密度在這些核團也明顯減少；NPY-IR 神經元密度在ARC和VMH明顯低于活動期，這些結果暗示了達烏爾黃鼠下丘腦神經元活動、NO及NPY合成對冬眠期的適應。

c-Fos 作為神經元激活標志，冬季達烏爾黃鼠下丘腦各核團c-Fos-IR 神經元較少，暗示了下丘腦神經元活動變弱，這與冬季處于休眠狀態有關。與此結果相似的是，冬季達烏爾黃鼠嗅球神經元活動也低于其他季節［20］。NO參與中樞神經系統攝食調節，增加NO 會增加食欲［24］。NPY 具有增強食欲和調控脂肪合成和儲存的作用，主要分布于下丘腦ARC，并有神經纖維投射到VMH 和LHA 形成的NPY 網絡，在機體攝食活動中發揮重要調節作用。當機體處于不同能量需求時，下丘腦NPY 能神經元可以直接調節攝食與消化功能，也可通過胃腸神經系統調節［25］。李艷莉等［26］對棕色田鼠（Lasiopodomys mandarinus）的研究發現，VMH 區NPY 對動物攝食和能量平衡具有重要調節作用，在能量需求增加或能量供應不足時，可激活下丘腦NPY 能神經元，刺激食欲，增加攝食量。達烏爾黃鼠在冬眠時能量需求降低，nNOSIR和NPY-IR神經元表達的降低暗示了食欲的抑制；相反，夏季能量需求增加，通過興奮下丘腦內NPY能神經元可提高食欲，增加攝食量，如對達烏爾黃鼠和大鼠尾蝠（Rhinopoma microphyllum）的研究表明，NPY 表達增加有助于冬眠前脂肪和體重增加［16，27］。本研究發現冬季LHA 區NPY-IR 表達量高于夏季，由于NPY 還參與胃腸功能調節，具有抑制小腸蠕動和胃腸轉運的作用［28?29］，進入冬眠后達烏爾黃鼠幾乎不攝食，高表達的NPY 可能與抑制胃腸功能有關，考慮到冬眠期達烏爾黃鼠胃幾乎是空的，LHA活動增加也是饑餓狀態的一種暗示［30］。在整個冬眠期，冬眠動物從入眠、深冬眠、激醒再到體溫恢復正常為一個冬眠陣，之后再進入下一個冬眠陣［12］。達烏爾黃鼠冬眠期的冬眠陣平均為7.55 個，陣間激醒時長平均為1.36 d［19］。LHA 雖是攝食中樞，同時也與覺醒有關［31?32］，LHA 的OX 參與睡眠-覺醒調節。NPY 對覺醒和睡眠具有雙向調節作用［33］，NPY 通過突觸前和突觸后機制能夠抑制OX神經元活動，繼而調節覺醒反應［34］。因此，冬季LHA 區NPY-IR 高表達不能排除與陣間激醒的相關性。

GHRL 是一種能夠促進食欲的胃腸激素，通過血腦屏障作用于中樞系統，具有調節能量平衡、睡眠、食欲和胃腸道蠕動作用［35］。GHRL 通過與中樞食欲調節神經元受體或外周代謝器官受體結合發揮作用。Alamri等［9］研究表明禁食會使血漿GHRL 升高，繼而刺激攝食行為，貯存脂肪。本研究結果顯示，夏季GHRL 含量高于冬季。作為一種促食因子，GHRL 可促進活動期達烏爾黃鼠攝食。冬季達烏爾黃鼠自發地停止攝食，處于冬眠狀態，與胃腸活動減弱相適應，GHRL 合成和分泌也相應地減少。CRH是一類抑食因子，同時也參與能量調節［5］。CRH 與受體結合后可通過抑制胃排空，增加飽腹感，降低食欲［36］。中樞或外周注射CRH，攝食量會顯著減少［37?38］。ARC 增食和抑食神經元投射到PVN，PVN產生抑食因子，如CRH 和TRH 等抑制食物攝取［1，5］。盡管外周激素水平不能表示其在中樞的水平，但在一定程度上能夠反映對環境刺激的響應［39］。CRH作為一種抑食因子，冬眠期達烏爾黃鼠血清CRH 濃度高于活動期，可能與冬眠期停止攝食有關。先前研究冬眠和覺醒過程中達烏爾黃鼠和多紋黃鼠（Spermophilus tridecemlineatus）甲狀腺素發現，血清T3和T4水平明顯高于非冬眠鼠［40?41］。此外，由于CRH在應激反應中的突出作用，高水平CRH 也可能與冬眠陣中冬眠激醒有關。

下丘腦監測機體穩態并調節不同行為，諸如攝食、產熱和睡眠等。冬季和夏季達烏爾黃鼠處于不同能量需求時，下丘腦NO 和NPY 能神經元激活程度不同。夏季達烏爾黃鼠處于活動狀態時攝食頻繁，下丘腦神經元活躍，作為促食因子，NO與NPY高表達促進了食欲并有利于體內脂肪積累。冬季與夏季外周GHRL 和CRH 濃度變化并不一致，提示了二者在季節適應中的作用不同，該結果有助于認識冬眠動物攝食生理的季節性調節。