HPLC外標法測定復方樟腦乳膏中甘草次酸的含量

敖 星,候海玲

(內蒙古自治區藥品檢驗研究院,內蒙古 呼和浩特 010020)

復方樟腦乳膏是臨床中治療濕疹、皮炎及蕁麻疹的常用藥物,該藥物主要采取外敷用藥方式[1]。不僅具有良好的止癢效果,同時其在抗炎以及抗過敏等方面也具有良好作用[2,3],在治療一些皮膚病如神經性皮炎、瘙癢癥和凍瘡時效果明顯,對帶狀皰疹和蚊蟲叮咬引起的疼痛也能起到防治作用[4]。本品不含激素,安全性較高。

本品為復方制劑,由樟腦、薄荷腦、水楊酸甲酯、苯海拉明、葡萄糖酸氯己定和甘草次酸共六種藥物組成,制劑中每克的標示量依次為40mg、30mg、20mg、10mg、2mg、3mg。制劑中的輔料有甘油、羥苯乙酯、液體石蠟、白凡士林、單硬脂酸甘油脂、硬脂酸、焦亞硫酸鈉、依地酸二鈉、聚山梨脂-80多種成分。[5]甘草次酸作為制劑中有效成分之一,具有抗過敏和抗炎的藥理作用[6-8]。本法根據復方制劑中的藥物特性,摸索出對甘草次酸進行含量測定的方法,為藥品質量標準的制定和提高提供技術支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

LC-20A型高效液相色譜儀;1260型高效液相色譜儀;Mettler AL204電子天平(百分之一)、Sartorius SA125P-1CE-DI(十萬分之一)、Sartorius MAX (SG EA)(百萬分之一)電子天平;Millpore 超純水機;KQ-500型數控超聲波清洗器超純水(自制),無水乙醇(分析純),甲醇(色譜純)

1.2 樣品

甘草次酸(C30H46O4)對照品,批號:110723-201715,純度:99.6%,購于中國食品藥品檢定研究院。共收集到5家生產企業的5批樣品進行試驗。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Waters Atlantis T3(4.6*250mm,5μm)色譜柱,以甲醇-水-冰醋酸(90∶10∶0.6)為流動相,檢測波長為250nm,流速1.0mL/min,柱溫30℃,進樣量20μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取甘草次酸對照品6mg,置于50mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取本品2g,置50mL量瓶中,加入適量甲醇,于60℃水浴振搖使甘草次酸溶解,放至室溫后用甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗

按復方樟腦乳膏處方,除甘草次酸外,取輔料2g,置50mL容量瓶中,照“2.2.2”同法操作,制備專屬性試驗溶液,進樣量設為20μL,上機分析測定,結果見圖1、圖2。

圖1 空白溶劑

圖2 專屬性試驗溶液

由圖可見,溶劑和藥用輔料在250nm的波長處沒有吸收,在甘草次酸出峰時間內對樣品測定不存在干擾,專屬性較好。

2.3.2 線性與范圍

精密稱取甘草次酸對照品適量,以甲醇為溶劑制成每1mL約含甘草次酸0.12mg的溶液,分別精密量取5、10、15、20、25、30μL注入液相色譜儀,得到試驗數據,再以進樣量(μg)及峰面積(A)為坐標進行線性回歸。甘草次酸線性方程為:Y=1677130.76x+9574.93(n=6,r=0.9999)。結果表明甘草次酸在0.6048～3.6288μg濃度范圍內與其峰面積呈線性關系。結果見表1。

表1 線性考察結果

2.3.3 重復性試驗

精密稱取本品2g,置50mL量瓶中,按“2.2.2”項同法平行制備6份供試溶液。進樣量設為20μL,上機運行并記錄色譜圖,代入上述回歸方程后計算,得到RSD為0.7%,證明本法的重復性較好。

2.3.4 精密度試驗

取“2.3.3”項下供試品溶液1份,測定6次,RSD為0.12%,結果說明本法有良好的儀器精密度。

2.3.5 穩定性溶液

按“2.2.2”項下方法制備1份供試品,在0、2、4、6h分析測定,6小時內峰面積RSD為0.21%,說明供試品溶液在6小時內仍比較穩定。

2.3.6 回收率試驗

取除甘草次酸外的陰性樣品2g,精密稱定,置50mL量瓶中,按下表加入對照品,再按“2.2.2”項下方法,得供試品溶液。進樣量設為20μL,將所得數據代入方程后計算,結果顯示,低、中、高三個濃度回收率在97.12%～101.26%,平均回收率為99.8%,9份回收率RSD為1.4%,表明該方法準確度良好,結果見表2。

表2 回收率試驗結果

2.3.7 耐用性試驗

按“2.2.2”項下方法,制得供試品溶液。分別對流速(0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min)、柱溫(30℃、35℃、40℃)、色譜柱(Waters Atlantis T35μm 4.6*250mm、CAPCELL PAK MGⅡC185μm 4.6*250mm)、儀器(島津LC-2010、Angilent1260)進行耐用性試驗考察,結果顯示各峰理論塔板數、拖尾因子及分離度均能達到檢測條件,說明本法有良好的耐用性。

3 樣品測定

取5個廠家的5批樣品,按“供試品溶液制備”同法操作,制備供試品溶液。進樣量設為20μL,將所得數據代入回歸方程后計算,結果見表3。

表3 樣品信息

4 討論

4.1 流動相條件的選擇

參考各企業注冊標準,分別對甲醇-水-三乙胺(94:6:0.1)(用磷酸調pH值至3.0)、甲醇-水-冰醋酸(85∶15∶0.6)、甲醇-水-冰醋酸(90∶10∶0.6)進行了考察(此實驗選用資生堂CAPCALL PAK MGⅡ 5μm 4.6*250mm色譜柱),三種流動相對甘草次酸的分離效果都不錯,考慮到節約試驗時間及簡化流動相配制方法,選用甲醇-水-冰醋酸(90∶10∶0.6)作為流動相。

4.2 提取溶劑的選擇

參考各企業注冊標準,綜合考慮,分別對甲醇、無水乙醇進行考察,發現甲醇提取的樣品峰形更好,理論塔板數更高,因此選擇甲醇作為提取溶劑。

4.3 提取方式的選擇

對超聲和直接振搖進行了考察,發現,直接超聲提取效率較低,需加熱超聲,加熱超聲溫度達到40℃時,大部分企業的樣品能夠分散均勻,目標成分容易提取出來,但個別企業的乳膏劑比較黏膩,無法充分分散,導致提取不完全,且提取不容易平行,因此選擇直接加熱振搖。再由各家工藝可知,甘草次酸是在乳化后冷卻至60℃時加入并開啟均質器及攪拌均勻,而且60℃時乳膏分散比較均勻,因此,選擇60℃進行振搖提取。