大薊生品及炭品中多糖不同提取方法的比較分析

劉智勇,張增弟,馬黃璜,張 靚

(1.福建中醫藥大學附屬人民醫院中藥房,福建 福州 350004;2.福建中醫藥大學附屬人民醫院臨床藥學,福建 福州 350004)

大薊是一種傳統中藥,為菊科植物薊Cirsium japonicum Fisch.ex DC.的干燥地上部分,大薊炭是大薊的炮制加工品。大薊具有涼血止血、祛瘀止痛的作用,還能夠起到抗菌、抗病毒、抗發炎、抗癌等作用[1]。該藥材化學成分復雜,含有三萜、甾體、揮發油、長鏈炔醇、黃酮、黃酮苷等化合物。多糖也是其中一種成分,其提取含量的影響因素較多,例如溫度、操作、浸潤程度、提取方法等等。提取方法主要有水提醇沉法、醇提除雜法、超聲輔助法、堿提醇法等等。近年來已有不少關于大薊中黃銅成分的有關文獻報道,但是關于多糖類成分的還不夠多[2-4]。為此,本文從本地擇取市售大薊飲片生品共計100個、炭品共計100個當做實驗標本,均接受水提醇沉法、醇提除雜法、超聲輔助法、堿提醇法進行多糖提取。探索各方法之間的多糖提取含量測定值差異性,詳情如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從本地擇取市售大薊飲片生品共計100個、炭品共計100個當做實驗標本。藥材:所有藥材均采購于福建福州,且被福建中醫藥大學附屬人民醫院池志珍副主任藥師鑒定過為大薊和大薊炭。儀器:產自天津市泰斯特儀器有限公司、型號為FW100的高速萬能粉碎機,型號為3100PC的紫外-可見分光光度計,產自國華電器有限公司、型號為HY-4的振蕩機,產自昆山超聲儀器廠、型號為KQ3200的超聲波清洗器,型號為Sartorius BS214-D的天平(1/萬),產自國華電器有限公司、型號為HH-2的數顯恒溫水浴鍋,型號為2NHW的電熱套,產自浙江上虞道墟張興紗篩廠的藥典篩。試劑:濃度為98%的濃硫酸(分析純),濃度為4%的苯酚(重蒸、分析純),純化水,產自江西省藥品檢驗所、批號為0833-9501的葡萄糖對照品,產自南昌鑫光精細化工廠的氯仿(分析純),產自天津恒興化學試劑制造有限公司的無水乙醇(分析純),產自天津市恒興化學試劑制造有限公司的正丁醇(分析純),娃哈哈純凈水。

1.2 方法

所有中藥均接受水提醇沉法、醇提除雜法、超聲輔助法、堿提醇法進行多糖提取。

1.2.1 水提醇沉法

將大薊生品、炭品使用中藥粉碎機處理為粉末狀,并通過三號篩備用。嚴格的稱取各10g、各3份的大薊生品、炭品置入燒杯中,加入200mL的純化水進行燒沸、煎煮2h、2次,將濾液合并、濃縮至60mL。再使用20mL的乙醚進行3次脫脂處理,利用sevag法(氯仿-正丁醇為5∶1、樣品-試劑為2∶1)進行脫蛋白,振蕩8min。以3500r/min的離心速度開展20min的離心處理,進行4次脫蛋白。取出其上清液,加入300mL的無水乙醇,靜置一夜時間。待其沉淀后收集起來,加入純化水進行溶解,轉移入100mL的量瓶中,最后用純化水進行相應刻度的定容、搖勻。

1.2.2 醇提除雜法

嚴格的稱取大薊生品、炭品各10g、各3份置于500mL圓底燒杯之中,加入200mL濃度為95%的乙醇進行1h的回流處理,并趁熱過濾,使用95%乙醇20mL對殘渣進行3次洗滌。然后將其與濾紙共同放于圓底燒杯中,加入150mL純化水,進行30min的水浴加熱提取,并趁熱過濾,用20mL的純化水對殘渣進行3次洗滌,將洗液合并后,濃縮至60mL。使用20mL乙醚進行3次的脫脂處理,使用sevag法進行脫蛋白,振蕩8min。以3500r/min的離心速度開展20min的離心處理,脫蛋白4次。取出其上清液,轉移入100mL的量瓶中,使用蒸純化水進行相應刻度的定容、搖勻。

1.2.3 超聲輔助法

嚴格的稱取大薊生品、炭品各10g、各3份,加入200mL的純化水進行30min的超聲處理后,進行4h的回流處理,并趁熱過濾,濃縮至60mL。使用20mL的乙醚進行3次脫脂后,使用sevag法進行脫蛋白,振蕩8min。以3500r/min的離心速度開展20min的離心處理,脫蛋白4次。取出其上清液,加入300mL無水乙醇,靜置一夜時間,待其沉淀后收集好,使用純化水進行溶解。之后轉移入100mL量瓶中,用純化水進行相應刻度的定容、搖勻。

1.2.4 堿提醇法

嚴格的稱取大薊生品、炭品各10g、各3份,加入0.5mol/L的NaOH,200mL,靜置一夜時間后進行過濾。在濾液中加入36%乙酸進行中和,得到膠狀沉淀。進行溶劑揮干,得到浸膏沉淀,并用純化水溶解。之后轉移至100mL量瓶中,用純化水進行相應刻度的定容、搖勻。

1.2.5 苯酚-硫酸比色法

①苯酚溶液的配備。精密稱取苯酚4.0002g,加入純化水進行溶解,并轉移至100mL的量瓶中,再利用純化水進行相應刻度的定容、搖勻、超聲,最后得到的即為濃度為4%的苯酚溶液。②苯酚-硫酸比色法。從以上各提取方法得到的100mL的待檢測溶液中分別取出0.2mL,放置于10mL的量瓶中,加入純化水進行相應刻度的定容、搖勻。然后再從中取出2.0mL,放置于25mL的具塞試管中,分別精密加入 4% 的苯酚溶液 1 mL,濃硫酸7 mL,搖勻,放置于沸水中加熱保溫 30 min,取出后放冷,以純化水為空白,于490 nm波長處測定吸光度(A)。根據線性回歸方程 A =0.487C + 0.042 6 (r=0.9945),計算出各待測溶液中的多糖含量,并換算出樣品中多糖含量。

1.2.6 對照品溶液的配備

嚴格稱取105℃干燥到恒重的葡萄糖10.00mg,放置于10mL的量瓶中,加入蒸餾水溶解后進行稀釋達到相應刻度,搖勻后即為1.00g/L的葡萄糖溶液。然后從中嚴格量取2mL溶液,加入雙蒸餾水并定容于10mL的量瓶之中,即為0.20g/L的對照品溶液。

1.2.7 精密度實驗

從上述對照組品溶液中嚴格吸取0.4mL,共6份,分別置入25mL的具塞試管中。對于體積不夠2.0mL的使用蒸餾水進行補充,然后加入4%苯酚溶液1mL、濃硫酸7mL,搖勻后放置于沸水中進行30min的加入處理,取出后放冷,取出,以純化水為空白,于490nm波長處測定A,計算出RSD0.40%,代表儀器的精密度為良好。

1.2.8 重復性實驗

嚴格稱取大薊生品供試品各10g,各5份,根據醇提除雜法制備方法對供試液進行配備,并按照標準曲線制作下的相同條件進行測定,計算出RSD0.34%,代表本實驗的重復性為良好。

1.3 觀察指標

多糖提取含量測定值:使用苯酚-硫酸比色法測定各提取方法得到的多糖含量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 多糖提取含量測定值

探索各方法之間的多糖提取含量測定值(表1)差異性,大薊生品中,含糖量最高的為超聲輔助法(t=17.058、26.230、153.894,P=0.000、0.000、0.000),其次為醇提除雜法、水提醇沉法、堿提醇法。大薊炭品中,含糖量最高的為醇提除雜法(t=2.095、12.444、100.492,P=0.037、0.000、0.000),其次為超聲輔助法、水提醇沉法、堿提醇法。使用超聲輔助法進行多糖提取時,大薊生品、炭品得到的含糖量基本相近(t=1.147,P=0.253),使用堿提醇法進行多糖提取時,大薊炭品得到的含糖量比生品顯著更高(t=34.234,P=0.000)。

表1 多糖提取含量測定值

3 討論

大薊是一種中藥材,在我國各地均有產出。其性涼、味甘、苦,歸心、肝經,能夠起到涼血止血、散瘀消腫的作用。該藥材化學成分十分繁雜,包括有黃酮、生物堿、揮發油、糖類化合物等等。藥理作用、臨床應用均十分廣泛。臨床中多用于肺結核、闌尾炎、乳腺炎、急性黃疸性肝炎等疾病的治療中[5-6]。該植物藥用價值極高,已被廣大學者選擇進行研究,但是對于抗菌、降壓等成分的研究還不夠深,僅僅停留在提取物層次。在大薊中,多糖是一種有效成分,近年來已被逐漸發現、應用。已經發現其藥理作用為抑菌、清除自由基,能夠影響機體抵抗衰老[7-8]。因此,找到對大薊進行多糖提取的高效方法至關重要。

常見的提取方法有水提醇沉法、醇提除雜法、超聲輔助法、堿提醇法等等。水提醇沉法是一種常見的大薊多糖提取手段,使用設備簡易,使用試劑實惠無害,操作也比較簡單,提取后得到的多糖含量也較高[9-10]。但是提取物中大概率會含有較多雜質成分,影響多糖測定結果。堿提醇法在大薊生品、炭品中多糖提取量均不高,因為該方法得到的多糖多為堿溶性、少部分為中性,沒有酸溶性多糖。且在進行酸中和時,因為溶液顏色的因素,無法準確判斷出膠狀沉淀,也會影響多糖提取含量。醇提除雜法指的是使用乙醇提取,將單糖、低聚糖、苷類、生物堿等等干擾成分去除干凈,再使用蒸餾水進行多糖成分的提取,最終得到的成分較純、含糖量較高,進行多糖含量測定時效果較好[11-12]。超聲輔助法和醇提除雜法相比,污染性更小,工藝過程也更簡單,提取量基本相當。和水提醇沉法相比,提取量更高,使用起來效果比較理想。

基于此,本文從本地擇取市售大薊飲片生品共計100個、炭品共計100個當做實驗標本。所有標本均接受水提醇沉法、醇提除雜法、超聲輔助法、堿提醇法進行多糖提取。以各方法之間的多糖提取含量測定值差異性展開探析。最終結果為:探索各方法之間的多糖提取含量測定值差異性,大薊生品中,含糖量最高的為超聲輔助法(P<0.05),其次為醇提除雜法、水提醇沉法、堿提醇法。大薊炭品中,含糖量最高的為醇提除雜法(P<0.05),其次為超聲輔助法、水提醇沉法、堿提醇法。使用超聲輔助法進行多糖提取時,大薊生品、炭品得到的含糖量基本相近(P>0.05),使用堿提醇法進行多糖提取時,大薊炭品得到的含糖量比生品顯著更高(P<0.05)。提示,超聲輔助法是大薊生品進行多糖提取的最佳方法、醇提除雜法是大薊炭品進行多糖提取的最佳方法。且使用超聲輔助法進行多糖提取時,大薊生品、炭品得到的含糖量基本相近,而使用堿提醇法進行多糖提取時,大薊炭品得到的含糖量比生品顯著更高。

探析其原因可能為:對于大薊生品來說,超聲會將其植物細胞壁破壞掉,使多糖更容易被提取出來[13-14]。對于大薊炭品來說,醇提除雜法能夠去除較多雜質,讓多糖測定效果更好,得到更高的吸光度,從而得到更高的含糖量。大薊炭品在炒炭過程中,自身組織結構被破壞,導致細胞多糖中堿溶性多糖更易被提取出,因此得到更高的含糖量[15]。

綜上所述,選擇超聲輔助法對大薊生品進行多糖提取、選擇醇提除雜法對大薊炭品進行多糖提取,得到的最終樣品含糖量較高。