雙波長HPLC法測定藤黃健骨片中地黃苷D、水晶蘭苷的含量

董清,支榮榮（江蘇省鹽城市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心,江蘇 鹽城 224055）

藤黃健骨片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ07942009[1]，由熟地黃、鹿銜草、骨碎補(bǔ)、肉蓯蓉、淫羊藿、雞血藤、萊菔子七味中藥組成，具有補(bǔ)腎、活血、止痛之功效。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)建立了HPLC測定淫羊藿苷含量，對于熟地黃、鹿銜草兩味主要組方僅建立了TLC鑒別法。王艷[2]等人補(bǔ)充建立了HPLC測定柚皮苷含量，顯微鑒別淫羊藿和鹿銜草。未見文獻(xiàn)報(bào)道對該制劑中熟地黃、鹿銜草兩味主要組分進(jìn)行含量測定。

熟地黃中活性成分地黃苷D具有滋陰補(bǔ)血和降血糖的作用[3]，鹿銜草中活性成分水晶蘭苷能抑制去卵巢大鼠模型中骨量減少，其可能具有抑制破骨細(xì)胞生成的能力[4-5]。王宥涵[6]等人通過建立體外破骨細(xì)胞的培養(yǎng)系，觀察了水晶蘭苷抑制破骨細(xì)胞生成的作用，并通過測定水晶蘭苷對NFATc1的表達(dá)水平，探討了可能作用的靶點(diǎn)。可見其藥理作用與中醫(yī)功效是相關(guān)的。

中國藥典2020年版已經(jīng)建立HPLC法測定熟地黃中地黃苷D、鹿銜草中水晶蘭苷的含量[7]。有關(guān)文獻(xiàn)對地黃苷D、水晶蘭苷的測定方法也有報(bào)道[8-9]，本文主要參考中國藥典建立的藤黃健骨片中地黃苷D、水晶蘭苷兩種成分的含量測定方法，為進(jìn)一步提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 Ultimate U3000型高效液相色譜儀，XS205DU電子天平，Milli-Q超純水系統(tǒng)，KH-500E型超聲儀，恒豐HH-4恒溫水浴鍋。

1.2材料 地黃苷D對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量：94.2%）、水晶蘭苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量：96.2%）；磷酸、甲醇、水等均為色譜純；藤黃健骨片（某企業(yè)三批次，規(guī)格：0.5g/片）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1熟地黃、鹿銜草主成分的含量測定

2.1.1色譜條件[7]色譜柱：SVEA opal C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇為流動相A，0.1%磷酸為流動相B（5∶95）；檢測波長：203nm（地黃苷D）、235nm（水晶蘭苷）；柱溫：30℃；流速：1.0mL·min-1；進(jìn)樣量均為10μl。

2.1.2對照品溶液的制備 取地黃苷D對照品15.94mg、水晶蘭苷對照品11.23mg，分別置入100ml量瓶中，加25%甲醇溶液制成每1ml含地黃苷D0.1502mg、水晶蘭苷0.1080mg的對照品儲備溶液（供加樣回收率試驗(yàn)用），分別精密吸取兩種儲備液1ml，置入10ml量瓶中，加25%甲醇溶液至刻度，制成含地黃苷D15.02μg、水晶蘭苷10.80μg的對照品混合溶液（供含量測定及線性關(guān)系考察用）。

2.1.3供試品溶液的制備 取本品細(xì)粉約0.5g，精密稱定，置入具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇溶液25ml，稱定重量，回流1小時（80℃），放冷，再稱定重量，用25%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4陰性對照溶液 按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制備工藝制備取缺熟地黃及缺鹿銜草的陰性樣品，各取0.5g，同供試品溶液的制備方法制備。

2.1.5專屬性試驗(yàn) 精密量取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10μl，按上述方法測定。結(jié)果表明，供試品在混合對照品溶液相應(yīng)的位置有色譜峰，熟地黃陰性樣品在地黃苷D的位置上無色譜峰，鹿銜草陰性樣品在水晶蘭苷的位置上無色譜峰。表明供試品中其他成分對目標(biāo)成分無干擾，本方法有良好的專屬性。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖。（1）地黃苷D、水晶蘭苷混合對照品溶液；（2）供試品溶液；（3）熟地黃陰性對照溶液；（4）鹿銜草陰性對照溶液。注：A.地黃苷D，B.水晶蘭苷

2.1.6線性關(guān)系考察 精密量取2.1.2對照品溶液1、2、4、10、16、20、30μl測定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對照品的質(zhì)量X（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程，結(jié)果表明，各成分在各自范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見表1。

表1 線性關(guān)系表

2.1.7精密度試驗(yàn) 精密吸取2.1.2對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，地黃苷D、水晶蘭苷峰面積的RSD分別為0.32%、0.88%（n=6），精密度良好。

2.1.8穩(wěn)定性考察 吸取供試品溶液，于0、6、12、24、48h分別進(jìn)樣10μl，按上述條件測定，地黃苷D、水晶蘭苷峰面積的RSD分別為0.50%、0.52%（n=2），供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品，按供試品溶液制備方法平行制備6份，依次測定，地黃苷D、水晶蘭苷的平均含量分別為0.4206mg·g-1、0.4522mg·g-1，RSD分別為0.88%、0.91%，重復(fù)性良好。

2.1.10加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品0.25g，六份，分別精密吸取2.1.2的地黃苷D、水晶蘭苷對照品儲備溶液各0.7mL（0.1051mg）、1.0mL（0.1080mg），按制備方法制得供試品溶液（對照品溶液體積代入公式計(jì)算含量）。分別吸取上述溶液各10μl測定回收率。見表2、表3。

表2 地黃苷D加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 水晶蘭苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.1.11樣品含量測定 依2.1.1方法測定3批樣品，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果(mg·g-1)

3 討論

3.1色譜條件的選擇 選擇了中國藥典2020年版一部熟地黃的流動相組分（鹿銜草的流動相組分與熟地黃相同）：甲醇為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B（5∶95）。該流動相比例條件下地黃苷D和水晶蘭苷分離度達(dá)到藥典要求，供試品中與其他成分均能較好分離。

3.2供試品提取方法 地黃苷D在25%甲醇溶液中溶解性較好，水晶蘭苷在水中溶解度較好[7]，兼顧兩種成分的溶解性，本文采用25%甲醇溶液同時提取兩種成分。藥典熟地黃采取了超聲處理方法，鹿銜草采用了水浴加熱的方法，本文比較了超聲和水浴回流，結(jié)果表明超聲處理對水晶蘭苷的提取效率較低，故采用了水浴回流（80℃）提取，本文還考察了溶劑體積、提取時間、回流溫度等因素，最終確定了2.1.3供試品制備方法。