探討外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析技術(shù)在腫瘤臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值

于欣,于霜,殷曉偉,楊玉柱（山東省單縣中心醫(yī)院,山東 菏澤 274300）

在臨床現(xiàn)代各項(xiàng)醫(yī)學(xué)技術(shù)逐步改進(jìn)和推廣的背景下，無創(chuàng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）檢測(cè)方式的特異性和敏感性不斷提升[1]，并在臨床得到了更多的應(yīng)用和更大的關(guān)注度。VONA學(xué)者在2000年時(shí)，首次通過健康血液細(xì)胞形態(tài)和大小，用顯微鏡方式觀察外周血狀況，進(jìn)而檢出CTC[2]。此項(xiàng)技術(shù)能完整顯示出CTC各表型，并具備成本低、便捷、快速等優(yōu)勢(shì)，利于后續(xù)開展研究和實(shí)驗(yàn)。當(dāng)前主流技術(shù)中，免疫學(xué)技術(shù)在腫瘤標(biāo)志廣譜檢測(cè)和特異性方面存在一定缺陷，會(huì)導(dǎo)致無法檢出異質(zhì)性CTC，而ISET技術(shù)缺陷為部分較大單核細(xì)胞易混淆在CTC中[3]，而部分較小CTC則易經(jīng)過濾而在檢測(cè)中出現(xiàn)漏檢的狀況。所以，現(xiàn)在暫無完美的檢測(cè)方式能完整捕捉到循環(huán)內(nèi)CTC。在鑒定CTC方面，仍然主要采用免疫學(xué)技術(shù)，但此方式具備標(biāo)志物特異性缺陷，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)具備較高靈敏度，但無法更為完整地觀察到細(xì)胞，而在形態(tài)學(xué)方法上則具備成本低、直觀、快速等優(yōu)勢(shì)[4]。本研究利用我國相關(guān)部門認(rèn)可的CTCBIOPSY異常細(xì)胞分離染色系統(tǒng)，納入2020年2月-2021年12月單縣中心醫(yī)院收治的120例腫瘤患者，歸類常見腫瘤患者外周血檢出CTC狀況，并分析此類基于ISET技術(shù)和形態(tài)學(xué)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的CTC方式應(yīng)用到臨床腫瘤檢驗(yàn)中所具備的價(jià)值。具體報(bào)告如下。

1 資料及方法

1.1一般資料 選取2020年2月-2021年12月單縣中心醫(yī)院收治的120例腫瘤患者作為研究對(duì)象，包含前列腺癌21例、乳腺癌25例、腸癌21例、肺癌53例；疾病TNM分期：I期24例、II期29例、III期30例、IV期37例；年齡34-78歲，平均為（58.65±1.02）歲；女性58例、男性62例。120例患者基本資料均滿足本研究各項(xiàng)條件和標(biāo)準(zhǔn)。各患者均接受首次手術(shù)后經(jīng)病理檢查得到確診，排除以往接受相應(yīng)醫(yī)療治療者、肝腎心肺功能性疾病者、精神/智力異常者。

1.2方法 采集各患者接受治療前肘靜脈血液4ml，將血液標(biāo)本置入含乙二胺四乙酸抗凝（EDTA）的真空采血管中，防止采血中出現(xiàn)上皮細(xì)胞污染，用第2管血液標(biāo)本進(jìn)行CTC檢測(cè)。完成采血后，上下?lián)u動(dòng)混勻采血管，充分混合抗凝劑和血液標(biāo)本，采集血液標(biāo)本后2h內(nèi)則需進(jìn)行檢測(cè)。

標(biāo)本前處理：用醫(yī)用乙醇75% 1ml潤洗濾器、NaCl 0.9% 2ml溶液進(jìn)行漂洗。將0.9% NaCl溶液3ml和固定劑（PFA 8%）200uL加入至15ml的離心管中，均勻混合后，再加入血液標(biāo)本5ml，均勻混合后，在室內(nèi)溫度下放置10min，再把標(biāo)本加入到濾器內(nèi)，用異常細(xì)胞分離染色儀（CTCBIOPSY，武漢友芝友公司提供）進(jìn)行檢測(cè)。完成分離后，把濾器取出，加入甲醇300uL至濾器中，在室溫下固定1min后，把濾膜取出，再把濾膜貼在玻片中間位置，室溫下將其晾干后，實(shí)施染色處理，50℃環(huán)境下干燥30min，滴入甘油100%進(jìn)行封片處理，再實(shí)施免疫組化鏡檢。

1.3指標(biāo)判定 油鏡觀察，評(píng)估富集細(xì)胞形態(tài)[5-6]：①細(xì)胞核異型性，表現(xiàn)為分葉狀、結(jié)節(jié)狀，呈不規(guī)則形狀；②細(xì)胞長(zhǎng)端（直徑）高出15um；③核質(zhì)比高出0.8；④核著色不均勻且深染；⑤核膜增厚，表現(xiàn)為皺褶或凹陷，核膜形狀為鋸齒狀；⑥細(xì)胞核核仁巨大或染色質(zhì)邊移，或出現(xiàn)異常核分裂狀況。評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：①CTC：滿足以上參數(shù)項(xiàng)目≥4個(gè)；②除⑥以外的項(xiàng)目，任意滿足3個(gè)或單一滿足評(píng)估參數(shù)⑥則可判定其為疑似CTC；③細(xì)胞成團(tuán)數(shù)目≥3個(gè)，則可判定為CTC，但因互相重疊或連接，則無法準(zhǔn)確評(píng)估為CTC細(xì)胞團(tuán)，則將其判定為循環(huán)腫瘤微栓（CTM）[7]；④≥3個(gè)細(xì)胞成團(tuán)，無法判定為CTC細(xì)胞團(tuán)，則評(píng)估呈疑似CTM[8]；⑤無法評(píng)估來源為血液的細(xì)胞，但也不滿足以上各類型的細(xì)胞，則標(biāo)記非血液細(xì)胞[9]。

本研究各患者標(biāo)本檢驗(yàn)均由醫(yī)院2名影像學(xué)科專業(yè)醫(yī)生負(fù)責(zé)，若產(chǎn)生意見分歧，則根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)商討確定結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用R軟件（3.5.0版本）分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)正態(tài)分布下用t檢驗(yàn)（±s），偏態(tài)分布的連續(xù)變量用中位數(shù)表示，Mann Whitney U檢驗(yàn)；χ2檢驗(yàn)分類變量，秩轉(zhuǎn)換等級(jí)變量后，再實(shí)施Mann-Whiney U檢驗(yàn)，若P＜0.05，則表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1外周血CTC形態(tài)學(xué)檢出狀況 此次120例腫瘤患者，共49例檢出CTC（40.83%），9例檢出CTM。通過進(jìn)一步檢驗(yàn)CD31、CD45抗體實(shí)施免疫組化驗(yàn)證，顯示49例存在CTC形態(tài)的患者和9例CTM患者檢出的CD31、CD45均為陰性，滿足CTM、CTC免疫學(xué)特征。

2.2CTC陰性組和陽性組各參數(shù)比較 CTC陽性組CTC計(jì)數(shù)、年齡高于CTC陰性組，CTC陽性組T4分期率51.02%高于CTC陰性組T4分期率8.45%，T2分期率16.33%、T1分期率4.08%、T0分期率0%低于CTC陰性組T2分期率26.76%、T1分期率35.21%、T0分期率1.41%；CTC陽性組N3分期率32.65%、N2分期率20.41%高于CTC陰性組的8.45%、12.68%，組間數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 CTC陰性組和陽性組各參數(shù)比較

2.3各腫瘤疾病中CTC檢出狀況 CTC陽性組中前列腺癌率52.38%、肺癌率45.28%、腸癌率47.62%、乳腺癌率16%，見表2。

表2 各腫瘤疾病中CTC檢出狀況

3 討論

本研究采用ISET形態(tài)學(xué)方式共檢出120例腫瘤患者CTC陽性49例。為深入分析此形態(tài)學(xué)CTC方式的特異性，此次檢測(cè)CD31抗體免疫組化類似CTM或CTC的血管內(nèi)皮細(xì)胞，證實(shí)CTC檢測(cè)假陽性率。在染色處理細(xì)胞核時(shí)采用蘇木素染色，細(xì)胞膜為棕黃色，即CD31或CD45為陽性，為血管內(nèi)皮細(xì)胞或血液細(xì)胞[10]。而細(xì)胞核染色為蘇木素，細(xì)胞膜附近未出現(xiàn)棕黃色，則CD31或CD45為陰性，表現(xiàn)為CTM或CTC。利用免疫組化方式得到證實(shí)，經(jīng)本形態(tài)學(xué)方式檢出CTM和CTC細(xì)胞，均滿足CD31、CD45的免疫學(xué)特征，則提示CTC形態(tài)方式和評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)之間的特異性較高。

同時(shí)，由本研究表2 可知，C T C 陽性組中前列腺癌率52.38%、肺癌率45.28%、腸癌率47.62%、乳腺癌率16%，組間差異顯著（P＜0.05）。有報(bào)告稱，同一種腫瘤疾病，其檢測(cè)方式不同，CTC特異性、敏感性也存在差異。如針對(duì)肺癌患者，Cellsearch方式檢出CTC患者占比達(dá)19%-39%，而ISET方式則顯示36%-50%的患者存在CTC[11]。目前，暫未發(fā)現(xiàn)具有特異性的腫瘤細(xì)胞靶標(biāo)，最具代表性的則為Cellsearch技術(shù)，但如果腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，則無法檢出CTC[12]。相比于免疫親和吸附技術(shù)，此次采用的方式能降低腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中表面標(biāo)志物改變的影響，進(jìn)而增強(qiáng)CTM和CTC檢出效率。

綜上所述，臨床通過測(cè)得CTC結(jié)果，能確保細(xì)胞完整性，對(duì)臨床快速評(píng)估各類型腫瘤CTC有積極意義，雖然檢測(cè)方式在敏感性方面無明顯優(yōu)勢(shì)，但其特異性較為理想。