宮頸細胞p16/MCM2雙項聯檢免疫細胞化學染色流程的探討與體會

李菲,段贊,王濤,卓靜,杜麗,詹世寧（江蘇省徐州市腫瘤醫院,江蘇 徐州 221000）

目前，在全球女性生殖系統惡性腫瘤中宮頸癌的發病率仍高居榜首，在我國，宮頸癌發病率依然呈上升趨勢。隨著人乳頭狀瘤病毒（HPV）疫苗的接種、宮頸癌篩查的普及以及醫療水平的發展，我國宮頸癌患者的5年生存率較之前有明顯的提升，但是不同地區之間依然存在較大的差異[1]。HPV檢測及子宮頸細胞學檢查是目前宮頸癌篩查的主要方法，然而這兩種方法聯合起來對患者進行分流依然存在漏診，尤其是子宮頸高級別病變[2-3]。免疫細胞化學技術（immunocytochemistry，ICC）在日常工作中已經成為形態學診斷中一種重要的輔助方法[4]。p16基因又稱MTS（multiple tumor suppressor 1）基因，屬于抑癌基因，在調節細胞周期G1-S期中起著關鍵作用，在HPV相關的宮頸上皮內病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）中，HPV的E7蛋白抑制Rb基因的活性，導致p16合成異常增加，高表達于細胞核及細胞漿中[5-6]。微小染色體維持蛋白2（Minichromosome maintenance protein 2，MCM2）是DNA復制中的啟動子，參與細胞周期的調控，表達于高增殖活性的細胞核內，表達過度被認為是細胞周期失調的標志[7-8]。有研究顯示，p16和MCM2高表達于宮頸上皮內病變中，且病變程度越高其陽性率越高，故此，p16和MCM2在宮頸上皮內病變的篩查及鑒別診斷中具有較高的應用價值[9]。筆者采用免疫細胞化學技術對宮頸細胞學標本進行p16/MCM2雙項聯檢染色，經過反復的探索與實踐，優化了相關染色流程，取得了較好的效果，現就染色流程、染色結果判讀及相關經驗體會總結如下。

1 材料與方法

1.1材料 收集徐州市腫瘤醫院2022年7月-2022年11月宮頸液基細胞學標本150例，年齡20-68歲，平均年齡44.5歲。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 宮頸脫落細胞保存液及p16/MCM2雙項聯檢ICC試劑盒均購置于重慶沃康科技有限公司，全自動免疫組化染色機（CWC-30）購置于寧波察微生物科技有限公司，所采用的試劑與儀器均通過重慶沃康科技有限公司的驗證。

1.2.2制片及染色主要流程 ①純化：于10ml離心管中加入4ml液基細胞分層液，套上過濾筒，再加入6ml細胞離散靜置后的中下層細胞懸液標本，2000r/min，水平轉離心10min，去上清液，加細胞緩沖液至1-3ml，在漩渦振蕩器上震蕩1min，使細胞混勻打散，制成細胞懸液。②制片：在制片單元中加入細胞預處理后的細胞懸液1ml，室溫靜置10min，倒去殘液，取出玻片室溫晾干。③固定：將細胞制片放入無水乙醇中，室溫孵育30min，室溫充分晾干。④修復：使用高壓修復方法，將細胞制片放入裝有檸檬酸鈉抗原修復液（pH6.0）的染色缸中，將染色缸放置于加有1/3水位的高壓鍋中，待加壓閥放氣時開始計時，修復時間15min，然后自然冷卻至室溫。⑤滅活和封閉：滴加內源性過氧化物酶阻斷劑100ul/片，室溫濕盒孵育10min，PBST清洗3次，每次1min，適度甩干（不可干片），滴加封閉劑，室溫下濕盒孵育10min。⑥一抗孵育：將試劑盒中的抗體稀釋液和p16一抗濃縮液混合后，加入到MCM2一抗濃縮液中，配置成p16/MCM2一抗工作混合液，滴加于細胞制片上，室溫濕盒孵育60min，PBST清洗3次（每次3min）。⑦二抗孵育：將試劑盒中的羊抗鼠二抗工作液加入到羊抗兔二抗工作液中，配置成羊抗鼠/兔二抗工作混合液，滴加于細胞制片上，室溫濕盒孵育30min，PBST清洗3次（每次3min）。⑧DAB染色：根據標本量，取適量的DAB染色底物和DAB染色劑緩沖液混勻制備成DAB工作液，滴加DAB工作液45-50ul/片，室溫濕盒孵育5-10min，蒸餾水沖洗3min。⑨red染色：根據標本量，按AP-red色原液：AP-red顯色緩沖液=1∶75進行AP-red工作混合液的配制。一抗和二抗孵育之后，細胞制片滴加AP-red工作混合液47ul/片，室溫濕盒孵育20min，蒸餾水沖洗3min。⑩復染：將細胞制片放入蘇木素染料中進行復染，流水沖洗3min，吹干。

封片：滴加中性樹膠、加蓋玻片，干片后，光學顯微鏡下觀察。

2 結果

在高級別鱗狀上皮內病變（high-grades quamous intraepithelial lesion，HSIL）（見圖1A）及非典型鱗狀細胞，不除外高級別鱗狀上皮內病變（atypical squamous cells，cannot exclude HSIL，ACS-H）（見圖1B）中異常細胞的細胞核顯紅色或者紅棕色，細胞漿顯棕色。在低級別鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）（見圖1C）及非典型鱗狀上皮細胞中意義不明確（atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US）（見圖1D）中，單個異常細胞核呈紅色且細胞核形態、大小異常。無上皮內病變或惡性病變（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）（見圖1E-F）的細胞核顯藍色/紅色（但細胞核形態正常）、細胞漿只有蘇木素襯染的淡藍色或者細胞核藍色/棕色、細胞漿棕色。

圖1 A：在HSIL中p16（+）/MCM2（+），異常細胞（細胞核顯紅色或者紅棕色，細胞漿顯棕色）≤5個。B：在ASC-H中p16（+）/MCM2（+），異常細胞（細胞核顯紅色或者紅棕色，細胞漿顯棕色）≥5個。C：在LSIL中p16（-）/MCM2（+），異常細胞（核呈紅色且細胞核形態、大小異常）≥3個。D：在ASC-US中p16（-）/MCM2（+），異常細胞（核呈紅色且細胞核形態、大小異常）≤3個。E-F：在NILM中p16（-）/MCM2（+），或p16（+）/MCM2（-），正常細胞（細胞核顯藍色/紅色，細胞核形態正常，細胞漿只有蘇木素襯染的淡藍色或者細胞核藍色/棕色、細胞漿棕色）

3 經驗體會

①不是所有的宮頸細胞保存液都適用免疫細胞化學技術，曾嘗試使用多家公司生產的細胞保存液，有些保存液制作出的片子效果欠佳，尤其是細胞量及染色效果方面并不理想。推薦沃康、HOLOGIC和泰普等細胞保存液。使用非推薦品牌的宮頸細胞保存液進行檢測時，存在非特異結合較強、特異性染色較弱的問題。②本科室曾將放置超過一周的陽性對照片玻片進行p16/MCM2雙項聯檢ICC染色，結果顯示陽性細胞數量遠遠低于在2℃-8℃冰箱保存且不超過一周的標本制作的陽性對照玻片。所以制作好的玻片標本不可長時間在空氣中保存，應存放于2℃-8℃冰箱中不超過一周時間，放置時間過久，細胞內的抗原成分會丟失。③黏液過多的標本易引起非特異性染色，故需在標本中添加適量的黏液液化劑。④推薦采用間接高溫高壓抗原修復法，此種方法抗原修復液消耗量較少，抗原修復效果較好，尤其是細胞核抗原。⑤建議采用專用的檸檬酸鈉抗原修復液（pH6.0）。⑥蘇木素復染后，由于red染料原因，不可進行分化、通透和脫水。⑦不同季節如果室溫不同，要適當調整red染色時間。⑧由于標本中含有黏液等成分，為避免標本溢出，往離心管中加入標本液時要傾斜離心管，沿管壁緩慢加入。⑨抗體濃度過高或者過低會引起非特異性染色或者定位不準確，從而影響染色結果。⑩滴加試劑要均勻且足夠，以免邊緣細胞不著色。11PBS沖洗要徹底，染色全程不可出現干片現象，以防止背景著色。12血性標本會引起非特異性染色及覆蓋鱗狀上皮細胞，對于血性標本可以離心處理吸取中間層細胞制片。

4 討論

根據2022年2月國家癌癥中心發布的最新的全國癌癥統計數據，在我國，宮頸癌發病率和死亡率仍呈上升的趨勢。人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染是引起宮頸癌的主要病因，高危型HPV持續性感染可引起宮頸上皮內病變和宮頸癌，一些外陰及陰道上皮內病變亦和HPV感染有關[10]。HPV檢測在臨床工作中現已被廣泛應用，但一些被感染的患者在自身免疫系統作用下會自行消除病毒，僅少部分高危型HPV持續感染會進展為宮頸癌，與病理組織學檢查結果存在一定的差異[11-12]。宮頸細胞學檢查是宮頸上皮內病變篩查的主要方法之一，但由于操作流程的差異，染色結果也不盡相同，致使宮頸細胞病理學診斷的一致性較差，存在漏診和誤診，尤其對于高級別鱗狀上皮內病變的漏診率較高，利用p16蛋白的檢測在一定程度上可以彌補TCT只觀察細胞形態的不足之處[13]。HPV的E7蛋白通過取代E2F轉錄因子而與Rb結合導致MCM2異常轉錄的啟動和S期誘導異常，使得MCM2在宮頸癌和宮頸上皮內病變中高表達。有研究顯示，HPV靈敏度高但特異度低，TCT特異度高但是靈敏度低[14]。鄭健[15]等人研究顯示MCM2免疫細胞化學檢測結果的靈感度和特異度均比HPV檢測結果高，普遍表達于宮頸上皮內病變中，且宮頸上皮內病變越重其陽性表達率越高，在宮頸癌及宮頸癌前病變中有較好的篩查作用。免疫細胞化學技術應用于宮頸細胞學雙染中具有簡單高效、結果準確、可重復等優點，能夠提高診斷率、減少漏診率，在一定程度上降低或避免了過度的陰道鏡檢查，可作為臨床宮頸癌篩查的一種方法[16-17]。研究顯示p16、MCM2在宮頸上皮內病變中同時存在異常表達[18]，另有研究顯示p16、MCM2同時高表達與高危型HPV的致癌活性直接相關，且聯合檢測p16、MCM2在宮頸上皮內病變的診斷中靈敏度高于宮頸細胞學的檢查，特異度高于HPV檢測[19]。

綜上所述，p16/MCM2雙項聯檢免疫細胞化學技術從蛋白水平來標記異常宮頸鱗狀上皮細胞，如果標本中僅有幾個異常的鱗狀上皮也能被標記出來，從而有效避免了漏診，并且對宮頸癌及癌前病變進行風險評估、對癌篩人群的分流提供了有效的幫助。良好的染色流程與方法對于結果的準確性至關重要。通過近期對染色流程的反復摸索與實踐，大大提高了p16/MCM2雙項聯檢免疫細胞化學技術的穩定性，為臨床醫師對患者病情的分析提供了極大的指導作用。