原發(fā)性硬化性膽管炎小鼠NK1R/TGF-β1/miR-31軸對膽汁瘀積及肝纖維化的影響

武云飛,張衛(wèi)彬,楊 成,李 博

錦州市中心醫(yī)院普外二科,遼寧錦州 121000

原發(fā)性硬化性膽管炎是臨床較為常見的進(jìn)行性非化膿性膽管疾病[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,原發(fā)性硬化性膽管以女性多發(fā),臨床主要以種肝內(nèi)外膽管損傷、肝內(nèi)膽汁淤積作為主要特征,同時合并其他自身免疫性疾病[2]。在病理學(xué)研究中,原發(fā)性硬化性膽管主要表現(xiàn)為肝內(nèi)膽管的進(jìn)行性破壞[3],進(jìn)一步造成局部病灶部位的炎癥反應(yīng)及纖維化,而隨著疾病的發(fā)展,最終會造成門脈高壓及肝硬化,嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量[4]。有研究報(bào)道指出,隨著疾病的進(jìn)展,門脈高壓呈進(jìn)行性進(jìn)展,肝纖維化程度升高,肝功能下降[5]。神經(jīng)激肽1受體(NK1R)對炎癥反應(yīng)水平有一定指導(dǎo)意義[6]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是肝臟細(xì)胞病變及纖維化的重要指標(biāo)。血清微小RNA-31(miR-31)最早被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞遷移的重要指征,但是近年研究認(rèn)為,miR-31對肝纖維化的不斷浸染具有積極意義[7]。本研究主要通過原發(fā)性硬化性膽管炎小鼠NK1R/TGF-β1/miR-31軸對膽汁瘀積及肝纖維化的影響,為臨床診斷及治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 120只雌性SPF級新生小鼠由中科院提供;體重180～217 g,平均(25.33±2.39)g;飼養(yǎng)條件:溫度(21±2)℃,濕度30%～70%,光照每晝夜12 h。

1.2儀器與試劑 儀器:酶標(biāo)儀(DNM-9602,北京普朗新技術(shù)有限公司);臺式高速冷凍離心機(jī)(TGL20M,JTLIANGYOU);恒溫水浴箱(HH-W420/W600);PCR儀[中科瑞泰(北京)生物科技有限公司]。試劑:Trizol 試劑(上海聯(lián)碩生物科技有限公司);試劑盒(上海羅氏)。

1.3方法

1.3.1模型構(gòu)建 將120只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為模型組、對照組、空白組3組,每組40只。模型組:腹腔注射聚肌胞苷酸(1%)建模,注射劑量5 mg/kg,每周注射2次,對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行隨機(jī)病理學(xué)檢測。對照組:腹腔注射等量的生理鹽水,注射劑量同模型組。空白組:不采取任何處理措施。

1.3.2標(biāo)本處理 取肝組織放入4%多聚甲醛固定中,后經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋等步驟后,行連續(xù)切片后封閉。根據(jù)常規(guī)步驟進(jìn)行Masson染色[1],鏡下觀察肝組織病理形態(tài)。

1.3.3研究方法 分別對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行眼眶采血4 mL,3 000 r/min離心10 min取上清。采用酶聯(lián)免疫試驗(yàn)檢測實(shí)驗(yàn)小鼠血清TGF-β1、TGF-β1水平,采用熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測miR-31水平。操作流程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.4觀察指標(biāo) 比較3組實(shí)驗(yàn)小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平,比較無明顯纖維化組、明顯纖維化組及早期肝硬化組實(shí)驗(yàn)小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平,比較膽汁淤積組及非膽汁淤積組小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平。

2 結(jié) 果

2.13組小鼠肝臟纖維化情況比較 取的樣本后通過Masson染色觀察3組小鼠肝組織結(jié)果變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白組、對照組肝組織結(jié)構(gòu)清晰,肝小葉完整,肝細(xì)胞索排列整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀排列,匯管區(qū)僅有極少量的纖維組織。肝纖維化模型組小鼠部分肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,有脂肪空泡、有大量炎癥細(xì)胞浸潤,并有假小葉形成,肝細(xì)胞普遍壞死,膠原纖維大量增生并形成纖維間隔。見圖1。

注:A為對照組;B為模型組;C為空白組。

2.23組小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較 3組小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),兩兩比較結(jié)果顯示,模型組NK1R、TGF-β1、miR-31水平高于對照組、空白組,差異均統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較

2.3不同肝臟纖維化情況小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較 無明顯纖維化組、明顯纖維化組、早期肝硬化組小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平差有在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩兩比較結(jié)果顯示,NK1R、TGF-β1、miR-31水平從高到低依次為早期肝硬化組、明顯纖維化組、無明顯纖維化組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同肝臟纖維化情況小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較

2.4不同膽汁淤積情況小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較 非膽汁淤積組NK1R、TGF-β1、miR-31水平低于膽汁淤積組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同膽汁淤積情況小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較

2.5相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示,實(shí)驗(yàn)小鼠的NK1R、TGF-β1、miR-31水平與肝臟纖維化情況(r=0.741、0.694、0.587,均P<0.001)及膽汁淤積情況(r=0.556、0.559、0.785,均P<0.001)均呈正相關(guān)。

3 討 論

肝纖維化是肝硬化前期的一種病理變化,多數(shù)造成慢性肝損害的因素均可能導(dǎo)致肝纖維化。在病毒感染、酒精及遺傳等各種致病因素影響下,肝細(xì)胞被破壞[8],反復(fù)性肝細(xì)胞損傷、修復(fù),以及細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)的沉積[9],從而引起肝臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,進(jìn)而引起肝纖維化。目前研究認(rèn)為肝纖維化及初期肝硬化通過適當(dāng)?shù)闹委熆梢缘玫娇刂坪湍孓D(zhuǎn)[10]。肝纖維化的診斷多采取肝臟穿刺活檢,但是肝臟活檢存在依從性不高、易受取材部位影響的局限性,而血清學(xué)指標(biāo)檢測簡便、快捷,并可有效避免由于取材造成的誤差,對于患者的預(yù)后評價(jià)更加直觀[11]。

本研究結(jié)果顯示,隨著實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟纖維化程度升高,實(shí)驗(yàn)小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平呈上升趨勢。有研究顯示,NK1R主要反映了機(jī)體免疫細(xì)胞的活性,隨著NK1R水平升高,進(jìn)一步調(diào)控局部病灶部位的SP水平,提升炎癥反應(yīng)水平[12]。而在肝硬化疾病的進(jìn)展中,自身免疫性細(xì)胞對于局部病灶部位的肝細(xì)胞及病毒造成損傷的肝細(xì)胞進(jìn)行吞噬,加劇疾病的進(jìn)展[13]。這提示在肝臟纖維病變過程中,NK1R可通過對自身免疫系統(tǒng)的上調(diào)作用,進(jìn)一步刺激機(jī)體的自身免疫細(xì)胞的激活,對于疾病的進(jìn)展具有主要意義。TGF-β1在肝細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究顯示,TGF-β1是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及分化的重要蛋白[14]。而在本研究中,隨著肝臟細(xì)胞的不斷纖維化病變,抑制IL-3、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)所誘導(dǎo)小鼠造血前體細(xì)胞和長期骨髓液體培養(yǎng)(LTBMC)的集落形成[15],并降低巨核細(xì)胞對IL-3和CSF的反應(yīng)性,進(jìn)一步造成病變細(xì)胞自身吞噬,而在不同膽汁淤積情況的分析中,隨著膽汁在肝細(xì)胞內(nèi)的不斷淤積,自身免疫細(xì)胞對于局部病灶部位的吞噬細(xì)胞對于損傷細(xì)胞的修復(fù)不斷增強(qiáng),而在此過程中造成的肝細(xì)胞的損傷也在升高,局部炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)級聯(lián)反應(yīng),進(jìn)一步促進(jìn)TGF-β1水平升高。miR-31最早在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),在肝臟細(xì)胞的纖維化的發(fā)展中主要通過NK1R、TGF-β的協(xié)同作用,進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞的壞死[16]。本研究結(jié)果顯示,NK1R、TGF-β、miR-31與肝細(xì)胞內(nèi)的膽汁淤積及肝臟纖維化的疾病進(jìn)程呈正相關(guān)。但是,本研究還存在一定的局限性,由于納入的樣本量較小,有待進(jìn)行大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

原發(fā)性硬化性膽管炎小鼠的NK1R、TGF-β1、miR-31和膽汁瘀積、肝纖維化程度均升高,且NK1R、TGF-β1、miR-31升高與膽汁瘀積及肝纖維化升高呈正相關(guān),可為臨床診斷提供一定的依據(jù)。