急性心肌梗死患者血清miR-133a、miR-499-5p表達與PCI術后冠狀動脈無復流的關系*

余 琴,梁麗艷,劉超群,方志敏,若 扎

新疆醫科大學第二附屬醫院心血管內科,新疆烏魯木齊 830063

經皮冠狀動脈介入(PCI)是治療急性心肌梗死(AMI)的重要手段,可短時間內開通閉塞血管,恢復缺血心肌的血流供應,挽救患者生命[1]。但部分AMI患者PCI術后易發生冠狀動脈(冠脈)無復流現象,導致心肌無有效的血流灌注,降低PCI獲益程度[2]。因此,尋找與AMI患者PCI術后冠脈無復流有關的指標,可為PCI術后冠脈無復流的防治提供參考。微小核糖核酸(miR)-133a為心源性miRNAs,不僅在心血管系統發育中發揮作用,也參與了心肌損傷的病理過程[3]。miR-499-5p在心肌細胞分化過程中起到重要作用,并通過多種信號通路影響心肌細胞內特異性基因表達,進一步損傷心肌[4]。結合miR-133a、miR-499-5p的作用機制,推測二者可能與AMI患者PCI術后冠脈血流恢復有關。鑒于此,本研究就血清miR-133a、miR-499-5p表達與急性心肌梗死患者介入術后冠脈無復流的關系分析如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 采用前瞻性隊列研究,選取2019年2月至2021年10月本院收治的290例AMI患者作為研究對象。所有患者及家屬均簽署知情同意書。納入標準:(1)符合《內科學(第9版)》[5]中AMI診斷標準,均為急性ST段抬高型心肌梗死;(2)發病時間<12 h。排除標準:(1)合并出血性疾病,如消化道出血、顱內出血等;(2)凝血功能障礙或血液系統疾病;(3)靶血管直徑<2.25 mm;(4)合并嚴重腦血管疾病、肝腎功能不全等;(5)血管嚴重鈣化,病變血管無法充分擴張;(6)對造影劑過敏;(7)術后隨訪期間死亡。本研究經醫學倫理委員會審批通過(倫審號:20190128014)。

1.2方法 (1)治療方法:所有患者均接受急診PCI術治療,手術相關操作參照《中國經皮冠狀動脈介入治療指南(2016)》[7]中相關標準進行。術后積極控制血壓、血糖等危險因素,口服抗凝藥物治療,如阿司匹林、氯吡格雷等,連續治療并隨訪3個月。(2)實驗室指標檢測。PCI術前使用乙二胺四乙酸鹽抗凝管采集患者空腹靜脈血12 mL。①取5 mL血液標本,使用PE-7200型血細胞分析儀(深圳市普康電子)測定白細胞計數(WBC)。②另取2 mL血液標本,自然沉淀2 h后,以1 000×g離心10 min,留取血漿-80 ℃保存待檢;采用ExC810型凝血分析儀(北京普利生儀器)測定血漿纖維蛋白原(FIB)。③另取3 mL血液標本,以1 500×g離心分離15 min,留取血清-80 ℃保存待檢,使用CLS380M型生化分析儀(泰州澤成生物技術)測定血清總膽固醇(TG)、甘油三酯(TC);采用化學發光免疫法測定血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)。試劑盒購自湖南菲科生物技術公司。采用酶聯免疫吸附試驗測定心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌紅蛋白(Myo)、腦鈉肽(BNP);(3)miRNAs檢測。取剩余血液標本2 mL,離心處理后,加入Trizol總RNA提取試劑750 μL、裂解液400 μL,以12 000×g離心15 min,取上清液400 μL,加入氯仿400 μL;再次12 000×g離心15 min,取上層無色水相600 μL,加入75%乙醇200 μL,8 000×g離心5 min棄吸附柱,取300 μL流出液,加入200 μL無水乙醇后,12 000×g離心30 s,棄流出液,留取吸附柱備用;隨后洗脫吸附柱中蛋白,加入漂洗液600 μL,使其與吸附柱充分反應后,將吸附柱中除miRNA外的雜質洗脫,12 000×g離心1 min,加入無核酸酶水30 μL,12 000×g離心2 min,得到總RNA提取液。采用實時熒光定量PCR測定miR-133a、miR-499-5p相對表達水平。miR-133a:正向引物為5′-ATGGTTCGTGCGTTTGGTCCCCTTCA-3′,反向引物為5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′;miR-499-5p:正向引物為5′-CGTGTCGACCAAGTCTGGGGTGAA AGAGAAG-3′,反向引物為5′-TGTGTCGACGGTCATGAGCTTGTTGAGGTTC-3′;內參U6:正向引物為5′-CTCCCTTCGGCACCACA-3′,反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件:95 ℃變性2 min,94 ℃變性20 s,60 ℃退火、延伸34 s,共45個循環。采用2-ΔΔCt法計算相對表達水平。

1.3冠脈無復流的判定方法及分組 全部患者均接受為期3個月的隨訪,隨訪期間一旦患者出現胸痛、血壓降低或復查心電圖提示ST段抬高,立即行冠狀動脈造影檢查明確患者冠脈血流情況,并依據心肌梗死溶栓治療(TIMI)分級[6]評估患者冠脈血流分級。0級:造影提示血管閉塞遠端無血流;1級:造影提示閉塞部位可通過血流,但無法到達遠端;2級:造影提示閉塞部位可通過血流并到達遠端,但充盈速度慢;3級:造影提示閉塞部位可通過血流且快速到達血管遠端。依據AMI患者PCI術后冠脈TIMI血流分級將患者分為無復流組與復流正常組,血流TIMI分級0～2級為冠脈無復流,TIMI分級3級為復流正常。

2 結 果

2.1AMI患者冠脈血流情況 隨訪3個月,290例AMI患者PCI術后TIMI分級1～2級66例(無復流組),3級224例(復流正常組),冠脈無復流發生率為22.76%(66/290)。無復流組發病至PCI時間長于復流正常組,差異有統計學意義(P<0.05)。無復流組與復流正常組患者其他一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較或n(%)]

2.2兩組實驗室指標比較 無復流組患者術前WBC、CK-MB、cTnI、miR-133a、miR-499-5p表達水平高于復流正常組,差異有統計學意義(P<0.05);組間其他指標比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組實驗室指標比較

2.3各因素影響AMI患者PCI術后冠脈無復流的回歸分析 將AMI患者PCI術后冠脈無復流情況作為因變量(0=復流正常,1=無復流),將結果2.2、2.3中差異有統計學意義的變量納入作為自變量(均為連續變量),行Logistic回歸分析,結果顯示,發病至PCI時間長,以及術前WBC、CK-MB、cTnI、miR-133a、miR-499-5p高均是AMI患者PCI術后血流TIMI分級低的危險因素(OR>1,P<0.05)。見表3。

表3 各因素影響AMI患者PCI術后冠脈無復流的Logistic回歸分析

2.4血清miR-133a、miR-499-5p對AMI患者PCI術后冠脈無復流的預測價值 將術前血清miR-133a、miR-499-5p作為檢驗變量,將AMI患者PCI術后冠脈復流情況作為狀態變量(賦值:1=無復流,0=復流正常),繪制ROC曲線,結果顯示,術前血清miR-133a、miR-499-5p及二者聯合預測AMI患者PCI術后冠脈無復流的AUC為 0.727、0.697、0.773,具有一定的預測價值。見表4、圖1。

表4 血清miR-133a、miR-499-5p對AMI患者PCI術后冠脈無復流的預測價值

圖1 血清miR-133a、miR-499-5p預測AMI患者PCI術后冠脈無復流的ROC曲線

2.5血清miR-133a、miR-499-5p預測AMI患者PCI術后冠脈無復流的決策曲線 以凈收益率為縱坐標,高風險閾值為橫坐標,繪制決策曲線,結果顯示,在閾值0.09～0.40、0.43～1.00范圍內,血清miR-133a、miR-499-5p聯合預測AMI患者PCI術后冠脈無復流的凈收益率優于單獨的凈收益率;且在高風險閾值0.00～1.00范圍內血清miR-133a、miR-499-5p聯合預測AMI患者PCI術后冠脈無復流的凈收益率>0,提示有臨床意義。見圖2。

圖2 血清miR-133a、miR-499-5p預測AMI患者PCI術后冠脈無復流的決策曲線

3 討 論

冠脈無復流是PCI術后常見的并發癥之一,主要是由于血管內皮細胞損傷、再灌注損傷、微血管痙攣等多種病理改變所致,嚴重可導致室顫、心室停搏等,增加AMI患者病死風險[8]。本研究中290例AMI患者PCI術后3個月冠脈無復流發生率為22.76%,與楊飛等[9]研究結果(22.33%)相近,提示AMI患者PCI術后冠脈無復流發生風險高。因此,尋找與AMI患者PCI術后有關的指標對術后冠脈無復流進行預測,從而早期采取預防、治療措施尤為重要。

本研究結果顯示,發病至PCI時間長,以及術前WBC、CK-MB、cTnI高是AMI患者PCI術后血流TIMI分級低的危險因素。發病至PCI時間越長通常提示AMI患者心肌缺血時間越長,心肌損傷程度越嚴重,心肌組織的微循環結構損傷越重,容易引起PCI術后心肌低灌注或無灌注,導致冠脈無復流的發生[10]。高WBC患者梗死部位易出現大量白細胞聚集,進而加重心肌損傷,并引起心肌組織的毛細血管阻塞,影響冠脈微循環的血流,導致無復流的發生[11]。CK-MB、cTnI是臨床常見的心肌損傷標志物,二者水平越高提示心肌損傷程度越重,微循環障礙越嚴重,AMI患者PCI術后越容易發生冠脈無復流[12]。MYO通常在AMI發病后2 h內升高,是AMI早期診斷的重要標志物,但本研究中兩組MYO差異無統計學意義(P>0.05),考慮主要原因是病例來源單一,樣本量較小。以上指標雖然與AMI患者PCI術后冠脈無復流現象有關,但臨床仍缺乏對PCI術后冠脈無復流現象的針對性治療,因此尋找新的客觀指標,預測評估AMI患者PCI術后冠脈無復流的發生,或可為AMI新的治療方案提供依據。

miR-133a包括多種核苷酸序列,分別定位于人類第18號與20號染色體上,可促進胚胎干細胞分化為成肌纖維細胞,并抑制成肌細胞分化為心肌細胞[13]。YAO等[14]研究證實,miR-133a表達與心房顫動、心肌纖維化有關。本研究發現,術前血清miR-133a水平越高,AMI患者PCI術后冠脈無復流風險越高。分析原因在于,高水平miR-133a可抑制結締組織生長因子表達,促進心肌纖維化,加重心肌細胞損傷,進而影響AMI患者PCI術后心肌血流灌注,導致冠脈無復流現象的發生[15]。SI等[16]通過動物實驗發現,circHipk3可通過結合miR-133a,促進結締組織生長因子的表達,進一步激活內皮細胞,減輕大鼠心肌損傷。何亞磊等[17]研究發現,急性冠脈綜合征患者血漿miR-133a表達顯著高于健康對照者,且其表達水平與冠脈病變程度顯著相關。本研究結果與上述研究一致。

此外,miR-499-5p的表達與冠狀動脈粥樣硬化及多種心血管疾病密切相關[18]。本研究結果顯示,術前miR-499-5p水平越高,AMI患者PCI術后冠脈無復流風險越高。miR-499-5p過表達會靶向調控CACNβ1的表達,進而影響心肌細胞的L-鈣電流,加重心肌損傷,影響PCI術后心肌血流灌注[19]。miR-499-5p高表達還能改變miRNA的靶向性,加重AMI患者PCI術后心肌組織應激反應,引起超負荷的心肌壓力,進而損傷心肌細胞,影響術后冠脈血流灌注,導致冠脈無復流的發生[20]。miR-499-5p高表達還能通過調控SOX6蛋白,引起血管內皮細胞的炎癥反應,導致AMI患者PCI術后發生血管炎癥損傷,影響血管功能,進而導致冠脈無復流的發生[21]。

ROC曲線、決策曲線分析結果顯示,術前血清miR-133a、miR-499-5p對AMI患者PCI術后冠脈無復流具有一定的預測價值;在高風險閾值0.00～1.00范圍內血清miR-133a、miR-499-5p聯合預測AMI患者PCI術后冠脈無復流的凈收益率>0,提示有臨床意義。進一步說明miR-133a、miR-499-5p可作為AMI患者PCI術后冠脈無復流的預測因子。因此,臨床可早期對擬行PCI術的AMI患者進行miR-133a、miR-499-5p檢測,對術后冠脈血流灌注恢復程度進行預測評估,尤其對miR-133a、miR-499-5p表達異常的患者,應早期采取相應的治療措施,如環化腺苷酸、能量合劑、肌苷等保護心肌藥物,減輕AMI患者心肌損傷,降低患者PCI術后冠脈無復流的發生風險。

綜上所述,血清miR-133a、miR-499-5p水平與AMI患者PCI術后冠脈無復流現象有關,可作為PCI術后冠脈無復流的預測因子,為AMI患者PCI術后冠脈無復流的預防、治療提供新的思路。但本研究也存在局限,如納入患者僅為急性ST段抬高型心肌梗死患者,隨訪時間較短,未進行長期隨訪跟蹤,且為單中心研究,納入樣本量相對較小,未來仍需要擴大研究范圍、延長研究時間,進行多中心大樣本量的研究對研究結論進行進一步驗證。