伴肝轉移性結直腸癌患者微衛星不穩定率與PD-L1/PD-1表達及預后的相關性研究*

江少鋒,楊曉琳,賀 瀅

湖南省腫瘤醫院/中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院:1.消化泌尿內一科;2.教學辦,湖南長沙 410006

微衛星指基因組中一段具有高度突變性的簡單重復序列,在DNA復制過程中微衛星序列發生增減突變即為微衛星不穩定(MSI)。根據MSI突變位點數量的多少可劃分為高頻MSI(MSI-H)、低頻MSI(MSI-L)及微衛星穩定(MSS)。國內最新的結直腸癌肝轉移診治指南[1-2]均推薦結直腸癌患者進行MSI檢測,進而為精準制訂治療策略提供依據。結直腸癌MSI-H的特點是早期MSI-H發生率約20%,晚期MSI-H發生率(約5%)遠低于早期[3]。早期結直腸癌相關的研究認為,MSI-H表明患者預后良好[4],且MSI狀態與程序性死亡配體1(PD-L1)/程序性死亡受體-1(PD-1)的表達具有相關性[5];而發生遠處轉移的晚期結直腸癌中MSI-H的臨床意義尚存爭議,其與PD-L1表達的關系也不清楚。本研究將在發生肝轉移的轉移性結直腸癌患者中分析MSI狀態與PD-L1表達、化療療效的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年3月在本院診斷為結直腸癌的472例患者作為研究對象。納入標準:(1)經活組織病理檢查診斷為結直腸癌;(2)伴肝轉移和無轉移的結直腸腫瘤;(3)有完整的臨床病理資料;(4)有完善的影像學資料可供評價腫瘤分期及療效。排除標準:(1)接受過放化療或靶向治療;(2)既往有其他惡性腫瘤病史;(3)合并除肝臟以外其他部位轉移。納入的472例結直腸癌患者中,伴肝轉移194例,無轉移278例。本研究獲得醫院倫理委員會批準,并取得所有患者的書面知情同意。

1.2方法

1.2.1MSI狀態的檢測及分組 取伴肝轉移的結直腸癌患者及無轉移的結直腸癌患者的原發灶,根據指南[1-2]推薦,采用免疫組化的方法檢測MSI。取病灶組織蠟塊,制作石蠟切片,對MutL蛋白同系物1(hMLH1)、MutS蛋白同系物2(hMLH2)、MutS蛋白同系物6(hMLH6)進行免疫組化染色。由2名高年資病理科醫生在雙盲條件下進行讀片,在400倍鏡下隨機觀察5個視野,細胞核呈棕色或棕黑色顆粒為陽性,陽性細胞占比<30%為陰性、≥30%為陽性。hMLH1、hMSH2、hMSH6 3個蛋白中2個及以上表達陰性判斷為MSI-H,1個表達陰性為MSI-L,3個均表達陽性為MSS。根據伴肝轉移的結直腸癌患者MSI狀態分為MSI-H組、MSI-L組、MSS組。

1.2.2PD-L1、PD-1 mRNA表達水平檢測 取伴肝轉移的結直腸癌患者的原發灶和轉移灶,采用總RNA提取試劑盒提取組織中的總RNA;采用cDNA第一鏈合成試劑盒對總RNA進行逆轉錄、合成cDNA,采用熒光定量檢測試劑盒對PD-L1、PD-1 mRNA表達水平進行熒光定量PCR檢測。反應體系:cDNA 1 μL、熒光定量檢測反應混合液10 μL,正、反向引物各0.6 μL,以去離子水補足至20 μL。PD-L1引物序列:正向5′-TAGCTAGCTAGTTAGTC-3′,反向5′-TCCAGGCTAGCTAGCTTA-3′;PD-1引物序列:正向5′-CGTAGGCGTTATGCGTATT-3′,反向5′-ATGCTATGCGTAGTAGCGT-3′。在熒光定量PCR儀上設置反應程序:95 ℃ 3 min,而后95 ℃ 15 s、特異性退火溫度(PD-L1 60.0 ℃、PD-1 62 ℃、β-actin 62.0 ℃)25 s、72 ℃ 30 s,重復40個循環,反應結束后得到循環曲線及循環閾值(Ct)。內參β-actin引物序列:正向5′-TAGCGTATGCGTTAGCTGA-3′,反向5′-ATTGCTGGCTGATTGCGTA-3′。按照公式2-ΔΔCt計算PD-L1、PD-1的mRNA表達水平。

1.3化療方案及療效評價 根據指南[1-2]給予患者FOLFOX系統性化療方案,共治療6個周期,化療后參照指南、按照實體瘤療效評價標準分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)和疾病進展(PD),計算客觀有效率、疾病控制率。客觀有效率=CR率+PR率,疾病控制率=CR率+PR率+SD率。

1.4手術預后的評價 伴肝轉移的結直腸癌患者化療后進行結直腸癌原發灶和肝轉移灶一期同步切除,手術后進行隨訪,隨訪截止時間為2022年4月30日,隨訪的終點事件為腫瘤發生復發或轉移,據此計算無進展生存時間。

2 結 果

2.1伴肝轉移與無轉移的結直腸癌組織MSI狀態比較 伴肝轉移的194例結直腸癌患者結直腸癌組織MSI-H 11例(MSI-H率為5.67%),MSI-L 70例(MSI-L率為36.08%),MSS 113例(MSS率為58.25%);無轉移的278例結直腸癌患者結直腸癌組織MSI-H 56例(MSI-H率為20.14%),MSI-L 84例(MSI-L率為30.22%),MSS 138例(MSS率為49.64%)。經檢驗,伴肝轉移的結直腸癌組織MSI-H率低于無轉移的結直腸癌組織,MSI-L率、MSS率高于無轉移的結直腸癌組織,差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.2伴肝轉移的結直腸癌患者MSI-H組、MSI-L組、MSS組臨床病理特征比較 伴肝轉移的結直腸癌患者中,MSI-H組、MSI-L組、MSS組患者性別、年齡、原發灶位置比較,差異均無統計學意義(P>0.05),分化程度、淋巴結轉移數目≥4個、肝轉移數目≥2個、化療前癌胚抗原(CEA)水平比較,差異均有統計學意義(P<0.05);兩兩比較顯示,MSL-H組低分化的比例、黏液腺癌的比例、淋巴結轉移數目≥4個的比例、肝轉移數目≥2個的比例、化療前CEA水平均高于MSI-L組和MSS組(P<0.05)。見表1。

表1 MSI-H組、MSI-L組、MSS組臨床病理特征比較

2.3伴肝轉移的結直腸癌患者中MSI-H組、MSI-L組、MSS組原發灶及轉移灶內PD-L1、PD-1表達水平的比較 伴肝轉移的結直腸癌患者中3組原發灶及轉移灶內PD-L1、PD-1表達水平比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較顯示,MSI-H組原發灶及轉移灶內PD-L1、PD-1的mRNA表達水平均高于MSS組、MSI-L組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 伴肝轉移的結直腸癌患者中MSI-H組、MSI-L組、MSS組原發灶及轉移灶內PD-L1、PD-1表達水平比較

2.4MSI-H組、MSI-L組、MSS組化療近期療效比較 MSI-H組化療近期療效客觀有效率、疾病控制率均低于MSI-L組、MSS組(P<0.05)。見表3。

表3 MSI-H組、MSI-L組、MSS組化療近期療效比較[n(%)]

2.5MSI-H組、MSI-L組、MSS組預后比較 隨訪過程中,MSI-H組11例患者全部發生進展,MSI-L組60例患者發生進展,MSS組90例患者發生進展。經Log-rank檢驗,MSI-H組的累積無進展生存率低于MSI-L組和MSS組(P<0.05);MSI-H組與MSI-L組化療的累積無進展生存率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 K-M生存曲線

3 討 論

結直腸癌的發生、發展過程中存在基因組不穩定,包括MSI、染色體不穩定及CpG島甲基化三方面[6],其中MSI在腫瘤發生、病理進展、預后轉歸中均發揮了重要作用[7-8]。MSI的發生與錯配修復基因突變或異常表達導致的錯配修復蛋白表達缺失有關,根據基因突變數量不同MSI被分為MSI-H、MSI-L和MSS,準確評估MSI的狀態能夠為制訂精準的結直腸癌治療策略提供依據。

近些年,臨床學者陸續開展了MSI與結直腸癌的相關研究,多數研究均支持早期結直腸癌中MSI-H的發生率高于晚期結直腸癌[7-8]。本研究對發生肝轉移的晚期結直腸癌和無轉移的結直腸癌進行了MSI狀態檢測和比較,結果顯示轉移性結直腸癌的原發灶內MSI-H率明顯降低(P<0.05),MSI-L率及MSS率明顯升高(P<0.05),這一結果與既往研究結果一致[7-9]。目前,MSI-H影響Ⅰ、Ⅱ期結直腸癌病理進展及預后的研究結果已被廣泛接受,Ⅰ、Ⅱ期結直腸癌MSI-H往往提示預后生存良好,可能原因是MSI-H會促進細胞毒性T淋巴細胞、Th1淋巴細胞的浸潤并促進癌細胞的清除[10-11]。但目前關于晚期結直腸癌中MSI與病情的關系尚存爭議。

當結直腸癌進展至晚期后,MSI-H造成的病灶內淋巴細胞大量浸潤會代償性增加免疫檢查點,促進癌細胞發生免疫逃逸,并形成了有利于癌細胞生長的微環境,在此基礎上腫瘤病灶不斷生長并出現相應病理特征的改變[12-13]。本研究結果顯示,與MSI-L和MSS的伴肝轉移晚期結直腸癌患者比較,MSI-H患者的低分化和黏液腺癌比例更高、淋巴結轉移數目和肝轉移數目更多、CEA水平更高(P<0.05)。另外,目前關于MSI狀態的研究認為,MSI-L和MSS在生物學特征和臨床特征上具有高度相似性,因而常常被歸為一類,本研究對MSI-L患者和MSS患者的比較也未發現腫瘤病理特征的差異。以上結果表明,MSI-H促進了伴肝轉移晚期結直腸癌的病理進展,包括分化程度變化、遠處轉移增多、CEA分泌增加。

研究認為,MSI-H在早期結直腸癌和晚期結直腸癌中的生物學作用均與腫瘤局部的免疫應答有關,MSI-H在結直腸癌早期促進淋巴細胞浸潤、加強抗腫瘤免疫應答,在結直腸癌晚期代償性增加免疫檢查點、削弱抗腫瘤免疫應答、促進癌細胞的免疫逃逸[12-13]。有研究顯示,結直腸癌免疫逃逸可能與PD-L1/PD-1途徑有關,PD-1是一個負性共刺激受體,PD-L1與受體PD-1結合后能夠向下游傳導抑制性信號,最終實現對淋巴細胞分化成熟及增殖的抑制效應[14]。結直腸癌中PD-L1和PD-1高表達與病理進展有關,二者也是預后不良的相關因素[15-16]。本研究結果顯示,MSI-H組患者原發灶和轉移灶中PD-L1和PD-1水平均高于MSI-L組和MSS組,提示MSI-H在伴肝轉移晚期結直腸癌的發生、發展過程中促進PD-L1/PD-1的表達,進而可能抑制抗腫瘤免疫應答、促進癌細胞的免疫逃逸。

對于確診結直腸癌時已發生肝轉移的患者,指南推薦采用系統性化療方案進行輔助化療,而后進行原發灶和轉移灶的切除手術[1-2]。一項胃癌相關的臨床研究證實,錯配修復MLH1表達缺失與化療耐藥相關,提示MSI狀態可能影響化療療效,進而影響預后[17]。本研究對伴肝轉移的結直腸癌患者進行新輔助化療,通過近期療效的評價可知:MSI-H患者的客觀有效率、疾病控制率均低于MSI-L患者和MSS患者(P<0.05),提示MSI-H會影響伴肝轉移的晚期結直腸癌患者的化療療效。在新輔助化療完成后進行手術切除,通過隨訪可知MSI-H患者的累積無進展生存率均低于MSI-L患者和MSS(P<0.05),提示MSI-H降低會對伴肝轉移的晚期結直腸癌患者的預后產生不利影響。

綜上所述,伴肝轉移的結直腸癌原發灶內MSI-H率降低,MSI-H與分化程度變化、淋巴結和肝臟轉移增加、CEA分泌增多等病理進展有關,也與PD-L1/PD-1表達升高、化療近期療效和遠期預后不佳有關。本研究結果為認識MSI狀態在轉移性結直腸癌中的作用提供了一定依據,提示檢測MSI對評估轉移性結直腸癌病理進展和預后、制訂精準治療方案具有積極價值。