GSTM5在骨髓增生異常綜合征細胞中的表達及意義*

常 青,董騰騰,虞亞菲,張兆怡,王 馳,李綿洋

中國人民解放軍總醫院第一醫學中心檢驗科,北京 100853

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組異質克隆造血干細胞疾病,主要表現為造血細胞發育不良、不同程度的造血功能低下、外周血細胞減少,并伴有進展為急性髓系白血病(AML)的風險[1-5]。DNA甲基化在細胞的分化、增殖、凋亡等方面起著不同的作用,啟動子區域的高甲基化水平會導致基因的表達沉默,進而基因功能受到抑制。在臨床治療中,高危患者更多地選用表觀遺傳學療法,比如去甲基化藥物[6-7]。本研究中所使用的地西他濱(DAC)即為去甲基化藥物,在過去幾年中被廣泛用作老年高危MDS患者的一線治療方案[8]。谷胱甘肽S-轉移酶Mu 5(GSTM5)主要通過與谷胱甘肽(GSH)特異性結合,降低機體氧化應激損傷及致癌因素的易感性,從而在一定程度下保護機體。相關研究顯示,GSTM5基因的多態性與患者的預后存在相關性[9]。本課題組前期關于MDS的研究發現,臨床骨髓樣本GSTM5基因啟動子區域存在高甲基化的狀態,使用1、2、10 μmol/L DAC處理MDS細胞SKM-1后,相較于對照組,GSTM5基因mRNA表達水平均顯著升高,GSTM5基因甲基化水平顯著降低,但目前尚缺乏關于GSTM5在MDS發病機制中作用的報道[10]。本研究建立了MDS細胞SKM-1的GSTM5過表達模型,并檢測了SKM-1細胞的增殖、凋亡、細胞周期及GSH水平變化,以期為GSTM5基因在MDS發生中的作用機制研究及MDS的靶向治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料來源 MDS細胞SKM-1細胞系由中國中醫科學院西苑醫院周慶兵主任課題組贈送。RPMI 1640完全培養液和無血清細胞凍存液均購自武漢普諾賽公司。去甲基化藥物DAC 購自美國MedChemExpress(MCE)公司,谷胱甘肽抑制劑丁硫氨酸亞砜亞胺(BSO)購自美國SIGMA公司。CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自東仁化學公司。RNA提取試劑盒購自新英格蘭NEBiolabs公司。DNA 提取試劑盒、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)mix試劑盒均購置于上海凱杰生物科技有限公司。RIPA蛋白裂解液、濃縮膠緩沖液、分離膠緩沖液、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸、ECL化學發光檢測試劑盒均購自索萊寶公司。BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司。Lipofectamine 3000、蛋白Marker購自美國Thermo fisher公司。

1.2細胞培養和轉染 將SKM-1 細胞培養于RPMI 1640完全培養液中,將培養瓶置于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞接種于六孔板,按說明書配制轉染體系,轉染24 h后提取細胞RNA和蛋白。SKM-1細胞分組:SKM-1(對照)、SKM-1-NC(空白載體)、SKM-1ovGSTM5(GSTM5過表達)。

1.3DAC和BSO處理 取對數生長期細胞接種于六孔板,每組3個復孔,分別加入 0、1、2、10 μmol/L DAC 200 μL,藥物作用72 h,此為本課題組前期試驗所用藥物濃度[10];40 μmol/L BSO 200 μL,藥物作用24 h,此為本課題組預試驗BSO處理所選用的濃度。

1.4RT-qPCR 用試劑盒法提取RNA,利用NanoDrop儀器對RNA進行檢測后,將RNA逆轉錄為cDNA,采用熒光染料法進行PCR反應,每組設置3個復孔。GSTM5基因的mRNA相對表達量采用2-ΔΔCt計算。引物序列:GSTM5正向引物為5′-ATGCCCATGACACTGGGGTACTG-3′,反向引物為 5′-CCATGTGGTTATCCATAACCTGG-3′;GAPDH正向引物為5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′,反向引物為5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。

1.5Western blotting試驗 使用蛋白裂解液提取蛋白后采用BCA法測定蛋白濃度,取20 μg蛋白上樣,經電泳后轉至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h后分別加入GSTM5一抗(1∶5 000)、GAPDH一抗(1∶10 000),4 ℃過夜,TBST洗膜后搖床孵育相應的二抗1 h,TBST洗膜后使用ECL超敏發光液進行曝光顯影,條帶灰度值使用Image J 分析。

1.6CCK-8試驗檢測細胞增殖能力 將處于對數生長期的SKM-1細胞加入96孔板內,每孔加培養體系100 μL,每組設置6個復孔,分別于培養第0、1、2、3天避光加入10 μL CCK-8 試劑,培養箱中孵育 2.5 h。采用酶標儀檢測 450 nm 處的吸光度(A)值。

1.7流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡 將SKM-1細胞培養48 h后離心收集,用PBS清洗細胞2遍,加入預冷的75%乙醇,4 ℃固定過夜。加入含 RNA 酶(100 μg/mL)的碘化丙啶(PI,50 μg/mL),室溫避光孵育30 min 后用流式細胞儀檢測細胞周期。另加入 Annexin V-APC 和 PI,避光孵育15 min,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8GSH檢測試劑盒檢定細胞GSH水平 用PBS清洗細胞1次,棄上清取細胞沉淀,使用試劑盒內檢測緩沖液重懸細胞后,轉速10 000×g,4 ℃離心10 min取上清液,稀釋后加入96孔板中,按說明書添加檢測試劑,室溫孵育25 min后,采用酶標儀檢測 420 nm 處的A值。

2 結 果

2.1SKM-1細胞GSTM5基因mRNA及蛋白表達水平 在SKM-1細胞中,過表達GSTM5基因組的GSTM5 mRNA及蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05),過表達GSTM5細胞模型構建成功。見圖1。

注:A為GSTM5 mRNA表達水平;B、C為GSTM5蛋白表達水平;**P<0.01。

2.2過表達GSTM5基因對 SKM-1細胞增殖能力的影響 對SKM-1細胞系過表達GSTM5處理后,SKM-1細胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)。見圖2。

注:*P<0.05,**P<0.01。

2.3過表達GSTM5基因處理對細胞周期和凋亡的影響 與對照相比,SKM-1細胞瞬時轉染GSTM5質粒48 h后,細胞凋亡率和細胞周期分布情況差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

注:A為過表達GSTM5對SKM-1細胞周期的影響;B為過表達GSTM5對SKM-1細胞凋亡的影響。

2.4過表達GSTM5基因處理及DAC處理SKM-1細胞后的GSH水平 過表達GSTM5基因處理的SKM-1細胞GSH水平顯著降低(P<0.05);在DAC處理組中,1、2、10 μmol/L濃度DAC處理的SKM-1細胞GSH水平差異均無統計學意義(P>0.05),但相較于0 μmol/L DAC處理,SKM-1細胞GSH水平均出現顯著降低(P<0.05)。見圖4。

注:A為過表達GSTM5對SKM-1細胞GSH水平的影響;B為不同濃度DAC處理對SKM-1細胞GSH水平的影響;**P<0.01。

2.5BSO處理對SKM-1細胞GSH水平和增殖能力的影響 GSTM5處于高水平表達時,細胞GSH水平顯著降低(P<0.05),在40 μmol/L BSO處理SKM-1細胞的第1、2、3天細胞的增殖均受到顯著抑制(P<0.05)。見圖5。

注:A為40 μmol/L BSO處理SKM-1細胞后GSH水平的變化;B為40 μmol/L BSO處理SKM-1細胞后對細胞增殖能力的影響;*P<0.05,**P<0.01。

3 討 論

目前MDS的早期鑒別診斷體系尚未建成,可應用的診療指標有限。在一定程度上,MDS可以理解為介于不明原因血細胞減少癥與AML之間的過渡狀態。MDS涵蓋了較為廣泛的病態表現,比如單系或多系的病態/無效造血、染色體核型異常、基因突變等。在MDS的早期,患者通常與健康人群血細胞指標無明顯差異,這使得疾病的早期診斷較為困難[11]。有研究發現,在接受DAC治療的患者中,MDS組達到緩解的比例尚為可觀,總體顯著高于AML組[12]。DAC作為甲基化相關研究的藥物,主要用于疾病潛在治療靶點與耐藥的驗證。

谷胱甘肽S-轉移酶(GSTM)通常被認為是參與致癌活性代謝物失活轉化的解毒酶,參與親電化合物的解毒,包括致癌物、治療藥物、環境毒素和氧化應激產物,這表明這些酶可能在致癌中發揮作用[13]。在胃癌相關研究中,GSTM5的mRNA高表達水平與患者的低總體生存率密切相關[14]。在Barrett′s發育不良和Barrett′s腺癌中,轉錄GSTM5基因啟動子區域甲基化和mRNA表達水平之間存在顯著的反向相關性,并且該病的發生可能與活性氧不良累積造成的氧化應激損傷有關[15]。在非小細胞肺癌中,GSTM5基因變異與患者總體生存率具有相關性,并且GSH水平也與患者總體生存率具有相關性[15]。本研究采用MDS細胞SKM-1成功構建了GSTM5基因過表達細胞模型。本研究結果顯示,上調GSTM5 基因表達對MDS細胞SKM-1的增殖能力起到了顯著抑制的作用,但對細胞凋亡和細胞周期的影響卻不明顯。

在膀胱癌的研究中,GSTM5在膀胱癌細胞中表現為啟動子區域高甲基化,過表達GSTM5處理后,不僅膀胱癌細胞的增殖能力受到明顯抑制,細胞GSH水平也明顯降低[17-18]。在本項研究中,同對照相比,過表達GSTM5與基因的SKM-1細胞GSH水平顯著下降(P<0.05)。此外,利用BSO處理SKM-1細胞,在降低GSH水平后,SKM-1細胞的增殖能力也受到了抑制。本研究結果在一定程度上說明了GSH水平會影響SKM-1細胞的增殖能力。本項研究仍有一定的局限性,但提示GSTM5在SKM-1細胞中發揮抗癌作用,并且由GSTM5導致的GSH水平降低可能介導這種抗癌作用。

綜上所述,上調GSTM5表達可顯著抑制MDS細胞的增殖。因此,GSTM5可能參與MDS的發病,并具有作為MDS診斷標志物的潛力。臨床醫生或可根據GSTM5對疾病進行早期評估。