基于AQP8、NHE3、CFTR探究參苓白術(shù)散對(duì)腹瀉幼鼠模型腸黏膜的保護(hù)作用及機(jī)制

王彥彬，王曉穎，徐國(guó)娟，戚敏敏，梁翠才，馬瑋瑋

（河西學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

腹瀉的臨床發(fā)病率較高，是由于多種原因造成的水、電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)失常，常表現(xiàn)為大便次數(shù)增多、大便性狀變化，多發(fā)生于6 個(gè)月～2 歲的兒童群體中[1]。水通道蛋白( aquaporins，AQPs) 是腸上皮細(xì)胞膜上負(fù)責(zé)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的主要蛋白[2]。跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白鈉氫交換體（Na+/H+ exchangers，NHEs）是腸道對(duì)Na+的吸收蛋白，可促進(jìn)腸道對(duì)Na+的吸收，進(jìn)而形成濃度梯度。Cl-的腸道吸收和分泌與囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）通道有關(guān)[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，腹瀉時(shí)，腸道黏膜中AQPs、NHEs、CFTR 會(huì)出現(xiàn)異常表達(dá)，使腸道黏膜對(duì)H2O、Na+、Cl-的通透性增加，致使水、電解質(zhì)在腸道內(nèi)大量聚集。參苓白術(shù)散屬于常用的經(jīng)典中藥方劑，目前廣泛用于小兒腹瀉的治療，多數(shù)患兒可從中獲益。但對(duì)于參苓白術(shù)散是否可通過(guò)影響腸黏膜AQPs、NHEs 和CFTR 的表達(dá)來(lái)治療腹瀉，目前尚未見報(bào)道[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)腹瀉幼鼠模型結(jié)腸黏膜AQP8、NHE3 和CFTR 的表達(dá)情況，探討參苓白術(shù)散的止瀉作用機(jī)制，旨在為參苓白術(shù)散治療小兒腹瀉提供現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論證據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

購(gòu)置雄性SD 幼鼠50 只，隨機(jī)取10 只設(shè)為正常組。其余40 只SD 幼鼠于每日上午予番瀉葉藥液灌胃，連續(xù)干預(yù)14 d，建立幼鼠腹瀉模型；建模成功后分為模型組、參苓白術(shù)散低、中、高劑量組，每組10 只。50 只SPF 級(jí)雄性SD 幼鼠的體重為80 ～100 g，平均（90.00±10.00）g。所有幼鼠均購(gòu)自甘肅蘭州獸研所。所有幼鼠均進(jìn)行1 周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，控制室溫在24 ～26℃，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與設(shè)備

（1）藥物及試劑：參苓白術(shù)散（購(gòu)于北京德壽堂醫(yī)藥有限公司，人參15 g、茯苓15 g、白術(shù)15 g、白扁豆12 g、山藥12 g、蓮子9 g、砂仁6 g、炙甘草9 g）；番瀉葉（購(gòu)于吉林省松遼制藥有限公司）；AQP8、NHE3、CFTR 一抗（購(gòu)于北京博奧森生物科技有限公司）；蘇木素- 伊紅（HE）染色液（購(gòu)于南京建成生物工程研究所）。番瀉葉水煎劑的制備：精確稱取番瀉葉400 g 浸泡于2000 mL 純凈水中，攪拌均勻后靜置30 min；用武火煮沸10 min，使其濃縮至1200 mL，用4 層紗布進(jìn)行過(guò)濾后即完成番瀉葉藥液的制備，藥物濃度最終為0.3 g/mL，置于4℃冰箱中備用。（2）實(shí)驗(yàn)儀器：高速冷凍離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、UVP凝膠成像系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)、切片機(jī)。

1.3 方法

（1）動(dòng)物分組。將50 只SPF 級(jí)雄性SD 幼鼠（體重80 ～100 g）分為正常組、模型組、參苓白術(shù)散低、中、高劑量組，每組10 只。除正常組外，其余各組用番瀉葉藥液灌胃，根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]確定番瀉葉藥液的濃度為0.3 g/mL。按10 mL/kg 灌胃，每日1 次，連續(xù)干預(yù)14 d，建立幼鼠腹瀉模型。正常組予等量蒸餾水灌胃。（2）給藥方法。為參苓白術(shù)散低、中、高劑量組使用參苓白術(shù)散藥液灌胃，給藥體積均為10 mL/kg ；低劑量組的給藥劑量為1.2 g/kg，中劑量組的給藥劑量為2.3 g/kg ；高劑量組的給藥劑量為4.6 g/kg。正常組、模型組予等量蒸餾水灌胃。各組均連續(xù)灌胃14 d。每3 天完成1 次體重稱量，并動(dòng)態(tài)調(diào)整藥物劑量。同時(shí)，給藥過(guò)程中觀察幼鼠情況，并完成糞便的收集。（3）標(biāo)本采集。對(duì)各組幼鼠進(jìn)行灌胃后，以3.5% 水合氯醛（10 mL/kg）完成麻醉，取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，常規(guī)清洗，一部分置于福爾馬林液中浸泡，一部分置于-80℃冰箱中凍存。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）幼鼠表征觀察。每日觀察并記錄幼鼠的皮毛色澤、活動(dòng)狀態(tài)和糞便性狀；稱量幼鼠的體重，計(jì)算其腹瀉指數(shù)。（2）HE 染色情況。取各組幼鼠的結(jié)腸組織，經(jīng)石蠟組織固定后完成切片的制備，并進(jìn)行常規(guī)的HE 染色，于光鏡下觀察結(jié)腸的病理改變情況[7]。（3）結(jié)腸黏膜的AQP8、NHE3 和CFTR 表達(dá)。用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組結(jié)腸黏膜AQP8、NHE3和CFTR 的表達(dá)情況。用Western blot 法檢測(cè)各組結(jié)腸黏膜中AQP8、NHE3 和CFTR 的含量[8]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組幼鼠的一般情況

2.1.1 幼鼠表征觀察 正常組幼鼠行動(dòng)靈活，精神狀態(tài)良好，飲食正常，毛發(fā)濃密有光澤，大便正常。與正常組比較，模型組幼鼠行動(dòng)遲緩，精神萎靡不振，毛發(fā)稀疏，伴有毛發(fā)脫落，肛門紅腫、周圍體毛有少量稀便沾染。與模型組相比，參苓白術(shù)散低、中、高組幼鼠的行動(dòng)靈活性、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度等情況均得到不同程度的改善。見圖1。

圖1 各組幼鼠表征

2.1.2 各組幼鼠體重、腹瀉指數(shù)的比較 正常組幼鼠體重增長(zhǎng)迅速，模型組幼鼠體重增長(zhǎng)緩慢，且差異明顯（P＜0.05）。參苓白術(shù)散各組體重均有明顯的增長(zhǎng)；參苓白術(shù)散組的腹瀉指數(shù)低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組幼鼠體重、腹瀉指數(shù)的比較（± s）

表1 各組幼鼠體重、腹瀉指數(shù)的比較（± s）

注：a 與正常組比較，P ＜0.05 ；b 與模型組比較，P ＜0.05。

組別 只數(shù) 體重（g）腹瀉指數(shù)造模前 干預(yù)后 造模前 干預(yù)后參苓白術(shù)散組低劑量組 10 102.98±9.52 138.41±15.67ab 0.00±0.00 0.63±0.14ab中劑量組 10 103.11±9.56 140.39±15.69ab 0.00±0.00 0.65±0.16ab高劑量組 10 103.03±9.53 139.63±15.68ab 0.00±0.00 0.64±0.15ab模型組 10 103.52±9.56 114.39±12.31a 0.00±0.00 0.85±0.14a正常組 10 102.99±9.51 142.98±16.72 0.00±0.00 0.00±0.00

2.1.3 各組幼鼠糞便的變化情況 除正常組外，其他組幼鼠在予番瀉葉藥液灌胃3 天后均出現(xiàn)糞便呈濕軟質(zhì)黏狀態(tài)、附著于濾紙上的情況。5 天后糞便成為夾雜黏液的水樣稀便，且排便次數(shù)增加。正常組的糞便為質(zhì)硬橢圓形糞便。與正常組相比，其他組幼鼠的糞便含水量和腹瀉指數(shù)均明顯更高。參苓白術(shù)散各劑量組給予相應(yīng)藥物干預(yù)3 天后，糞便基本成形，質(zhì)地濕軟。5 天后糞便皆為成形便，含水量明顯下降，但是與正常組的糞便相比，還是偏松軟。見圖2。

圖2 參苓白術(shù)散各劑量組幼鼠的大便性狀

2.2 各組幼鼠結(jié)腸黏膜的形態(tài)學(xué)變化

與正常組比較，模型組幼鼠的結(jié)腸黏膜表皮細(xì)胞壞死明顯，且其結(jié)腸黏膜伴有毛細(xì)血管的擴(kuò)張，存在少許中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)；與模型組比較，參苓白術(shù)散各劑量組幼鼠的結(jié)腸黏膜表皮細(xì)胞凋亡壞死、固有層毛細(xì)血管擴(kuò)張充血和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯改善。見圖3。

圖3 各組幼鼠結(jié)腸黏膜的形態(tài)學(xué)變化

2.3 免疫組化法檢測(cè)AQP8、NHE3 和CFTR 的表達(dá)情況

與正常組比較，模型組幼鼠結(jié)腸黏膜AQP8、NHE3 的表達(dá)下降，CFTR 的表達(dá)升高。與模型組比較，參苓白術(shù)散各劑量組幼鼠結(jié)腸黏膜AQP8、NHE3的表達(dá)明顯升高，而CFTR 的表達(dá)明顯下降。見圖4。

圖4 免疫組化法檢測(cè)AQP8、NHE3 和CFTR 的表達(dá)情況

2.4 Westernblot 法檢測(cè)AQP8、NHE3 和CFTR的含量

與正常組比較，模型組幼鼠結(jié)腸黏膜AQP8、NHE3 的含量減少，CFTR 的含量增加。與模型組比較，參苓白術(shù)散各劑量組幼鼠結(jié)腸黏膜AQP8、NHE3的含量明顯增加，而CFTR 的含量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖5。

圖5 各組幼鼠結(jié)腸黏膜中AQP8、NHE3 和CFTR 含量的比較

3 討論

發(fā)生腹瀉時(shí)，常會(huì)并發(fā)脫水、電解質(zhì)及酸堿平衡紊亂。結(jié)腸是腸道中吸收水和電解質(zhì)的主要場(chǎng)所，AQPs 的作用主要是調(diào)節(jié)胃腸道內(nèi)的水液代謝，維持機(jī)體內(nèi)水液含量的相對(duì)穩(wěn)定[9]。哺乳類動(dòng)物的已知AQPs 有13 種。在其胃腸道中，至少存在11 種AQPs。其中AQP1、AQP3、AQP8 在結(jié)腸中的表達(dá)水平較高，其表達(dá)水平能直接影響消化道疾病的發(fā)生和發(fā)展[10]。既往研究表明，AQP1、AQP3、AQP8 的表達(dá)水平與結(jié)腸的水液代謝有關(guān)。NHEs 共有9 個(gè)亞型。其能參與上皮細(xì)胞鹽的運(yùn)輸，從而影響細(xì)胞中pH值、細(xì)胞體積。NHEs 是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其生理作用是使Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外的同時(shí)使H+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。其是腸道對(duì)Na+的吸收蛋白，可促進(jìn)腸道對(duì)Na+的吸收，進(jìn)而形成濃度梯度。Na+是維持組織液、血漿滲透壓、腸黏膜內(nèi)外水電解質(zhì)平衡的關(guān)鍵因素[11]。腸道對(duì)電解質(zhì)的吸收，主要是建立在對(duì)Na+吸收的基礎(chǔ)上。CFTR 是ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette，ABC）超家族中的一種，其作用機(jī)制的關(guān)鍵是為氯離子跨上皮運(yùn)動(dòng)提供了選擇性通道[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)與正常組相比，模型組幼鼠結(jié)腸黏膜AQP8 和NHE3 的表達(dá)水平顯著降低，而CFTR 的表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明腹瀉可能與AQP8 和NHE3的表達(dá)水平降低、CFTR 的表達(dá)水平升高有關(guān)。與模型組比較，參苓白術(shù)散各劑量組幼鼠結(jié)腸黏膜AQP8、NHE3 的含量明顯增加，而CFTR 的含量明顯減少，說(shuō)明參苓白術(shù)散可能是通過(guò)上調(diào)AQP8 和NHE3 的表達(dá)水平、下調(diào)CFTR 的表達(dá)水平來(lái)起到止瀉的作用。

綜上所述，參苓白術(shù)散可通過(guò)調(diào)節(jié)幼鼠腸黏膜AQP8、NHE3、CFTR 的表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)其體內(nèi)的水液代謝，并能減輕結(jié)腸黏膜受損，起到止瀉的作用。