獼猴源毛滴蟲的鑒定

蒙笑

摘要：本研究以18個 SrRNA和5.8個 SrRNA基因為基礎，對引起獼猴腹瀉的腸內毛滴蟲病進行形態學觀察，并對其進行了病理切片、碘液染色。通過對三毛滴蟲18 SrRNA、五毛滴蟲5.8 SrRNA的序列進行 PCR分析，對其進行了序列比較，并建立了演化樹。形態學分析表明，毛滴蟲為梨形或接近卵形，2～5條營養體前鞭毛和1條后鞭毛；三毛滴蟲18 SrRNA、五毛滴蟲5.8個 SrRNA序列的 PCR分析只得到18個 SrRNA，而18個 SrRNA的測序與 GenBank公司公布的三毛滴蟲胚胎序列有97.2%的相似性。通過對猴源毛滴蟲的形態學和分子生物學的研究，證實其為獼猴源三毛滴蟲，該研究為獼猴腸內寄生蟲的鑒別和檢測提供了依據。

關鍵詞：獼猴；三毛滴蟲；形態觀察；18SrＲNA序列；基因分析

0 引言

獼猴是一種重要的非人類靈長目，是研究人體健康與疾病的理想動物，在普通環境下飼養的獼猴，會被寄生體感染，寄生蟲感染對獼猴的健康和對試驗結果的影響很大。三毛滴蟲是一種寄生在動物的腸道內的寄生蟲，造成動物的反復拉肚子，對身體的養分吸收有很大的影響，嚴重地威脅到了它們的生命，嚴重威脅到了獼猴的養殖。迄今為止，關于三毛滴蟲屬的形態學、分子生物學等已在豬、貓等物種中進行了大量的研究，但關于其形態及分子特征的研究卻很少。本文以獼猴腸道毛滴蟲體為研究對象，利用18 SrRNA基因序列，對毛滴蟲進行了精確的鑒別，為毛滴蟲病的臨床診斷提供了依據。

1 病原毛滴蟲的分類及其形態特征

毛滴蟲屬于原蟲門、鞭毛蟲綱、動鞭毛綱、毛滴蟲目、毛滴蟲科、毛滴蟲屬、三毛滴蟲屬[1]。

1.1 寄生于人的毛滴蟲

已知四種可寄生于人體的毛滴蟲，即人五毛滴蟲、弱雙核阿米巴、口腔毛滴蟲、陰道毛滴蟲，主要為陰道毛滴蟲。人五毛滴蟲是一種寄生在人類和哺乳類動物的腸道中的寄生蟲，具有卵形的細胞核和1個副基器，具有4條前鞭毛、1條獨立的前鞭毛、1條后鞭毛，后鞭毛從波動膜的左邊一直到蟲體的末端脫離波動膜，并在體外游離。軟質雙核阿米巴是阿米巴型的鞭毛蟲，寄生在人體的結腸黏膜上，沒有包囊，只在滋養體期；直徑7～12μm，長有假足，寬而透明，尖端有分支；由于其結構及抗原特征都屬鞭毛蟲，因此將其歸入毛滴蟲科。口腔毛滴蟲寄生在牙垢和齲洞中，前鞭毛4條，后鞭毛沒有游離端，僅有一個核，在蟲體前方；柱狀結構細長，沿著昆蟲的尾端延伸。

1.2 寄生于動物的毛滴蟲

1.2.1 寄生于豬的毛滴蟲

可感染豬的毛滴蟲有多種分類方法，可以為臨床診斷和治療提供重要依據，因此，應用形態學和分子生物學的方法進行分類分析更具有科學性。利用三毛滴蟲體18 SrRNA和5毛滴蟲5.8 SrRNA的形態學分析，對毛滴蟲進行了初步的分析，結果表明，三毛滴蟲體與犬胚胎具有97.2%的相似度。研究發現，在獼猴體內的毛滴蟲為三毛滴蟲，在標本中未發現三毛滴蟲和五毛滴蟲的雜交，為獼猴體內腸道寄生蟲病的診斷和治療提供依據[2]。

巴特里四毛滴蟲是一種常見的寄生蟲，主要分布在盲腸、結腸，有時在小腸內，其體形較圓三毛滴蟲、豬三毛滴蟲為卵形；動作迅速，方向不定，常做環形動作，形體變化較大；前部有3～4條不同長度的鞭毛，從尾端向后伸展，呈3～5條波紋。三毛滴蟲以鼻道、胃、盲腸為主要寄生蟲；在小腸中發現有結腸，其形態為長梭，有時為梨狀；動作迅速，3條相同長度的鞭毛在身體的前方，并有一條橫穿整個身體的波膜。三毛滴蟲（T.ro tun da）是一種寄生于盲腸、結腸的寄生蟲，其形態一般為梨形，有時為圓形或卵形，其活動速度較豬三毛滴蟲和巴特里毛滴蟲慢，具有3條前鞭毛，長度基本相同，起伏膜的改變為光滑或波浪狀。三毛滴蟲（T.fo et us）是一種寄生在豬腸中的寄生蟲，其外形為卵形，具3～6條前鞭和1條后鞭毛。

1.2.2 寄生于反芻動物的毛滴蟲

三毛滴蟲可在牛生殖道內寄生，而人五毛滴蟲則能在牛、鹿的腸道內寄生。

1.2.3 寄生于犬貓等寵物的毛滴蟲

三毛滴蟲、人五毛滴蟲等均能在犬、貓的腸道中傳播。人五毛滴蟲有感染人類和動物的危險。

2 毛滴蟲的致病性及其危害

毛滴蟲主要是在人體和脊柱的消化和排泄器官中傳播，而在幼蟲的營養期則是它的主要感染期，主要是由糞便、食物等途徑傳播，或者是由宿主傳播，在宿主被感染后，會發生二次分化，以吸收滲出液、細菌等物質為養分，在適宜的環境下，培養基在適宜的環境中大量增殖，營養液呈圓形，鞭毛向內層分化，并在體外生成一個球狀假囊泡，毛滴蟲可附著于靶臟腺上皮，并可致毒，導致了靶臟癌的發生。人類五毛滴蟲是一種寄生于哺乳動物體內的生物共患病的生物，經調查發現，人類五毛滴蟲除了在犬貓之外，在其他種類的非靈長目和嚙齒類的排泄物中也發現了人類五毛滴蟲[3]。人五毛滴蟲是由人和動物誤吃而感染的，比如感染了人的飲水和食品，比如蒼蠅等，感染后會出現痢疾、肺部感染、風濕性關節炎等。

本報告確認：陰道毛滴蟲、口腔毛滴蟲可引起結膜及腦脊液、腎臟的炎癥，除了口腔的毛滴蟲之外，還在肺、胸膜等部位存在著可引起呼吸道疾病的陰道毛滴蟲和人五毛滴蟲。豬毛滴蟲可通過糞便接觸、交配、污染飼料等途徑傳播，通過飲用水等途徑進行傳染，其隱性傳染的比例很高，如果在不健康的環境下，可以發展成豬毛滴蟲病，主要是以痢疾為主。

有研究顯示，豬三毛滴蟲會引起陰道炎、頑固性痢疾。三毛滴蟲病是一種常見的寄生蟲，可通過公牛或其精液傳染給母牛，造成三毛滴蟲病，造成不育癥，早期流產，或子宮積膿。嬰兒三毛滴蟲會引起貓拉肚子，研究表明，不管貓咪有沒有感染癥狀，都有三毛滴蟲病。禽毛滴蟲是一種常見的寄生蟲，主要是在家禽、火雞、鴿等動物的消化道上傳播，可以通過飲水和飼料傳播，一般是因為吃了鴿奶，也有可能是吃了帶有蟲子的鴿子而傳染的。前胃發生壞死性潰瘍，使上消化道、呼吸道堵塞，影響飲食和呼吸，從而導致動物死亡。近年來，我國的毛滴蟲病發病率呈逐年上升趨勢，一旦出現腹瀉、不孕、生長遲緩或誘發其他疾病等多種癥狀，對我國養殖業的發展將產生很大的影響[4]。

3 材料與方法

3.1 樣本

在開放式環境下，隨機選取30只獼猴，其體形消瘦，脫水，糞便呈黃棕色。

3.2 儀器及試劑

日本（Olympus）、PCR（美國）、DNA電泳組（美國）、凝膠成像機（美國）。2 xTaqPCR MasterMix及糞便基因組 DNA的抽提儀、可再生膠液再生試劑盒、盧戈碘液染色劑。

3.3 顯微鏡觀察

將1滴生理鹽水滴入載玻片中心，用竹簽將少量糞便蘸入生理鹽水中，涂成一層薄薄的、均勻的糞膜，用光學顯微鏡觀察其大體形態和營養液的形態。

3.4 毛滴蟲濃集

選擇在低倍顯微鏡下，每一視場中的5只以上的毛滴蟲營養體排樣。用針筒將5ml的糞便樣品在15ml的離心管中輕輕地抽出來，再加5ml的生理鹽水，混合均勻，用一層消毒紗布濾掉2次；然后加入5ml的生理鹽水和濾料混合，用2層或3層紗網過濾2遍，每隔一段時間將沉淀物除去，用3500r/min的離心機進行5min的分離。稍稍晃動，除去上部液體和中間的污物，在2ml的離心式管子底部沉淀1ml，加入1ml的生理鹽水，在3500 r/min的條件下進行5min的離心，然后將剩余的液體丟棄。采用管底粗體標本進行碘溶液的浸漬及 DNA的抽取。

3.5 碘液染色

將濃縮后的試樣10ml放于1.5ml的離心機中，然后加10μl盧戈碘溶液，混合均勻，放置30s，等染色后將10μl滴在玻璃杯上，用玻璃罩遮蓋，放在一般的光學顯微鏡下。

3.6 獼猴毛滴蟲基因組DNA提取及PCＲ鑒定

采用濃縮處理的管底物樣品，根據樣品規格進行了糞便 DNA抽取，測定 DNA含量>40ng/μl，OD260/OD280為1.7～2.0。

3.6.1 18SrＲNA基因序列擴增

三毛滴蟲屬18 SrRNA的引物：P1（5'-GCTCG TAGTCAGC-3'）；下游的引子P2（5’-CCCAATTAG AACTCTATCTC-3'）對18 SrRNA的基因進行了擴增。PCR反應系統：1ml的模板，12.5ml2 xTaqPCRMasterMix，1ml的上、下游引物和25ml的ddH2O，在72℃下延長5min。用1%的瓊脂凝膠電泳法對10μm PCR產物進行鑒定，然后用膠再生試劑箱對目標 DNA進行分離，然后進行 DNA序列測定。

3.6.2 5.8SrＲNA基因序列擴增

五毛滴蟲5.8 SrRNA的引物：P3（5’-TGCTTCAG TTCAGCGGTCTTCC-3'）；在此基礎上，對（5'-CGG

TAGGTGAACCTGCCGTTGG-3'）進行了分析。PCR方法按3.6.1進行。PCR反應：94℃，5分鐘前進行預處理；94、53、72℃、1min、35次。在72℃下延長5min。用1%的瓊脂凝膠電泳法測定10μlPCR的結果。

3.7 序列比對分析與進化樹構建

采用MegAlign軟件和 BLAST方法進行了同源比對，并使用 MEGA7.0建立了一個系統演化樹，對不同種源之間的親緣關系進行了分析。

4 結果

4.1 形態觀察

在高倍顯微鏡下，可以觀察到大量的梨形、月牙形或類似卵形的蟲體，它們的移動方向不確定，在蟲體的末端有一條較粗的軸桿狀突起，用碘溶液染色后，蟲體的形狀為卵形或梨形，蟲體末節有一條鞭毛突出，稱為后鞭毛；用油鏡觀察到的是昆蟲的前鞭，但是用常規的光學顯微鏡很難準確地判別出鞭毛數。經形態學分析，從猴腸中分離出的毛滴蟲可以被初步鑒定為猴源。

4.2 獼猴源三毛滴蟲18 SrRNA和5毛滴蟲5.8 SrRNA基因的克隆和序列分析

用1%的瓊脂糖凝膠電泳法對 PCR產物進行了分析，結果表明，9份 PCR產物的目標基因條帶在500～750 bp之間。對目標基因條帶進行分離、測序，得到了三毛滴蟲18 SrRNA基因序列，共656個 bp。用1%的瓊脂糖凝膠電泳法對五毛滴蟲5.8 SrRNA基因片段進行 PCR分析，沒有得到300～400 bp的基因條帶。利用 DNASTAR的 Clustalw方法，將18個 SrRNA序列與 GenBank上的代表性序列進行比較，結果顯示，從腹瀉狗的糞便中分離出的三毛滴蟲（三毛滴蟲）18 SrRNA序列（注冊號：AY754332）與其基因序列的相似性最高[5]。

4.3 18SrRNA基因序列的系統演化樹

結果：從獼猴糞中分離出的蟲體與已報告的狗胚胎三毛滴蟲18 SrRNA（注冊編號：AY754332）和從污水中分離的人用三毛滴蟲18 SrRNA（登記編號：KU939249），與其他毛滴蟲的親緣關系更近。通過對18 SrRNA基因序列的分析，確定了獼猴腸內的毛滴蟲是猴源性三毛滴蟲。

5 討論

本文通過對獼猴的毛滴蟲致病特性的分析，以及利用形態學和分子學相結合的方法對其進行鑒別的文獻資料，為進一步的分析和評價該技術的應用奠定了基礎。毛滴蟲的一生很短，只有一種營養物質，它的典型特點是：1個梨狀或橢圓狀，2～4條或3～5條前鞭，1條后鞭毛。如果是在惡劣的環境中，比如突然的氣溫變化，或者是有藥劑的作用，那么，營養液就會出現一些形態學上的變化，從而導致營養液的表層出現凹痕，并讓鞭毛向營養體內凹陷。通過對30例猴子的糞便進行涂片法的研究，結果表明：被毛滴蟲病1例、阿米巴原蟲1例、感染鞭蟲1例，其他均無發現，以毛滴蟲為主要病原體。此次在獼猴體內見到的是一只蝌蚪形的毛滴蟲，其移動方向是不確定的，前鞭毛2～5條，后鞭毛1條，但常規顯微鏡下難以正確識別，也沒有三毛滴蟲鞭毛。通過對其形態學的研究，可以將其作為猴源性的毛滴蟲進行初步的研究。

在不同種類的情況下進行分類學的研究，對于臨床上的疾病和疾病的診治有著重大的指導作用，所以采用常規的形態學和分子生物學的方法進行分類學分析是比較科學的。采用三毛滴蟲體18 SrRNA和5毛滴蟲5.8 SrRNA的形態學方法，對毛滴蟲進行了初步的檢測，發現從獼猴體內提取的三毛滴蟲體與狗胚胎中的18 SrRNA RNA有97.2%的相似性。結果表明，從獼猴體排泄物中得到的毛滴蟲是三毛滴蟲，采集樣品中沒有三毛滴蟲與五毛滴蟲的雜交。本實驗為獼猴體內的腸道寄生蟲病的診治奠定了基礎。

參考文獻

[1] 王宏，趙德明，季維智，等.獼猴小袋纖毛蟲形態學觀察及分子生物學鑒定[J].中國獸醫學報，2019，39（1）：7480.

[2] 李建華，韓紅衛，宮鵬濤，等.豬三毛滴蟲長春株的形態觀察及其5.8SrＲNA基因分析[J].中國獸醫科學，2019，40（2）：121-124.

[3] 陳玲霞，尹博文，李振宇，等.樹鼩鞭毛蟲的形態學觀察及其18SrＲNA基因分析[J].中國比較醫學雜志，2018，25（11）：58.

[4] 陳玲霞.樹鼩腸道病毒宏基因組的初步研究及毛滴蟲的鑒定[D].中國醫學科學院北京協和醫學院，2017.

[5] 孟瑩.犬源毛滴蟲的分離鑒定及其生物學特性研究[D].吉林大學，2019.