黑木耳發酵多糖酸奶的研制與工藝優化

舒逸凡，宋克超，徐潔，吳小軍，曾曉雄

1. 南京農業大學食品科技學院（南京 210095）；2. 南京思農生物有機肥研究院有限公司（南京 211899）；3. 陜西秦峰農業股份有限公司（商洛 711499）

黑木耳（Auricularia auricula）屬真菌類擔子菌綱，是一種富含碳水化合物和蛋白質的可食用真菌，主要分布在中國、韓國、日本、泰國等地區[1]。黑木耳具有高營養價值并兼備多種藥理功能，其中黑木耳多糖（Auricularia auriculapolysaccharides，AAP）是黑木耳中最主要的活性物質。近年來有許多文獻報道稱黑木耳多糖具備免疫調節[2]、抗氧化[3]、降血糖[4]、抗腫瘤[5]及抗凝血[6]等生物活性。因此，黑木耳具備較高的開發功能食品的潛力。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是一種源于茯磚茶的曲霉科真菌[7]，作為一種潛在的益生菌，冠突散囊菌可利用多種碳源，尤其能分泌多種胞外酶，如纖維素酶、蛋白酶和多酚氧化酶等，因此也經常被用于谷物和豆類的加工[8-9]。有研究表明在提取多糖的過程中使用真菌發酵能使發酵后的多糖結構多樣化，提高其生物活性[10-11]，同時能夠提升相關功能性食品品質，改善產品風味、色澤等感官品質，增強其營養價值和保健價值[12]。

對于黑木耳的利用大多停留在粗加工階段，對于以黑木耳為原料的深加工產品的開發還處于初級階段[13]。酸奶是一種益生菌發酵食品，其中的益生菌能夠代謝黑木耳多糖，形成更小分子的多糖或修飾其結構，產生新的活性功能，增強產品的藥理作用，提高活性物質的生物利用度[14]。此外，真菌多糖能夠促進乳酸菌的生長，并且減弱消化液對乳酸菌的影響，有利于乳酸菌在宿主體內發揮作用[15]。因此將黑木耳、冠突散囊菌及乳酸菌發酵結合，能使黑木耳深加工產品具備美味、營養、功能多樣化等特點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳（陜西秦峰農業股份有限公司）；巴氏殺菌奶、白砂糖（市售）；保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌（西安蘭杉生物科技有限公司）；冠突散囊菌（MK346334，南京農業大學食品科技學院）[16]；PDB瓊脂培養基、MRS瓊脂培養基（上海盛思生化科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

AY120電子天平（日本島津公司）；LRH-150系列電熱恒溫培養箱（上海恒科學儀器有限公司）；HH-S24S 數顯恒溫水浴鍋；LDZX-50KBS滅菌器（上海申安醫療器械廠）；PEN3型電子鼻（德國AIRSENSE）。

1.3 試驗方法

1.3.1 冠突散囊菌的培養

將保存的冠突散囊菌（MK346334）接種于PDB瓊脂培養基上，活化培養7 d，待金黃色菌絲長滿平板培養基后，用接種環刮取平板上的孢子于無菌水中，使孢子液濃度為1×107CFU/mL，制得孢子懸浮液，備用[17]。

1.3.2 黑木耳發酵多糖的制備

黑木耳發酵多糖的制備參照已報道的黑木耳多糖提取方法[18]。黑木耳經洗凈后烘干，用高速粉碎機粉碎成粉末，將黑木耳粉末按照1︰100（g/mL）料液比加入去離子水，在90 ℃水浴條件下浸提3 h，過濾得到黑木耳水提液，經120 ℃滅菌20 min后接種冠突散囊菌（5%冠突散囊菌孢子液），于28 ℃恒溫搖床中以120 r/min培養7 d。培養結束后以5 000 r/min離心10 min，上清液真空濃縮至合適體積，加4倍體積乙醇沉淀，沉淀復溶、透析，濃縮、凍干即為黑木耳發酵多糖。

1.3.3 黑木耳多糖的電子鼻分析

稱取1 g多糖樣品于20 mL頂空瓶中，將密封好的頂空瓶置于50 ℃水浴鍋中平衡30 min，插入電子鼻探頭測定多糖樣品香氣。電子鼻參數：沖洗時間60 s，調零時間10 s，樣品準備時間5 s，檢測時間120 s，內部流量300 mL/min，進樣流量300 mL/min。

1.3.4 黑木耳發酵多糖酸奶的制作

原料乳→調配（加入1%發酵多糖和6%白砂糖）→殺菌（62~65 ℃滅菌30 min）→冷卻至40 ℃后接種（加入質量分數5%的活化菌種）→密封保溫發酵（42 ℃發酵8 h）→后熟（轉移至4 ℃冰箱保存12 h）

1.3.5 酸奶乳酸菌活菌數測定

取1 g后熟12 h的酸奶樣品，加入9 mL無菌生理鹽水混合均勻制得10-1的樣品均勻稀釋液，依次進行類比稀釋，制備10倍系列稀釋樣品勻液，分別選取0.1 mL 10-5，10-6和10-7這3個梯度的稀釋液在MRS固體培養基上涂布，在37 ℃條件下培養48 h后計數，做3次平行測定[19]。

1.3.6 酸奶持水力測定

準確稱定空離心管的質量并記為m0，將后熟的酸奶置于離心管中，準確稱其質量記為m1，以3 500 r/min離心10 min，離心后靜置10 min，除去上清液后準確稱量其質量并記為m2。持水力按照式（1）計算[20]。

表1 電子鼻各傳感器對應敏感物質

1.3.7 單因素試驗設計

以多糖添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）、發酵時間（6，8，10，12和14 h）和白砂糖添加量（2%，4%，6%，8%和10%）為自變量設計單因素試驗，并對其進行感官評定。

1.3.8 正交試驗優化黑木耳發酵多糖酸奶工藝

在單因素試驗基礎上，分別以不同的多糖添加量、發酵時間以及白砂糖添加量為考察因素，進行感官評定評分，采用三因素三水平正交試驗確定酸奶工藝的最優比，正交因素水平見表2。

表2 黑木耳發酵多糖酸奶優化正交試驗因素與水平

1.3.9 感官評分

優選10位審評人，參照酸奶感官評分標準（表3），從色澤、組織狀態、氣味與口感風味方面對黑木耳發酵多糖酸奶進行感官評分，評分滿分為100分。

表3 黑木耳發酵多糖酸奶感官評分標準

1.4 數據統計分析

試驗數據均重復測定3次，用平均值±標準差形式表示，數據差異顯著性采用SPSS（statistical package for social sciences）進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 黑木耳發酵多糖的制備及其香氣成分探究

圖1顯示冠突散囊菌對黑木耳提取液的發酵過程。結果表明，在發酵第2天開始出現白色的冠突散囊菌球狀菌絲體，在發酵第5天菌絲體直徑可達5~6 mm，在發酵第7天發酵液出現渾濁現象，可能存在菌絲體的自溶，因此在第6天終止發酵。發酵結束后離心，上清液經濃縮、醇沉等步驟得到黑木耳發酵多糖。

圖1 冠突散囊菌發酵黑木耳提取液過程

電子鼻從50 s之后傳感器響應值趨于穩定，因此選擇50 s時的電子鼻響應值進行分析。圖2（A）為發酵前后多糖樣品的主成分分析（PCA）分析結果，PCA1和PCA2的貢獻率分別為74.44%和14.72%，解釋度為89.16%，說明PCA分析具有可行性。PCA分析結果表明發酵前樣品和發酵后樣品香氣特征具有顯著性差異（P=0.013），因而通過冠突散囊菌發酵顯著改善黑木耳多糖的香氣。結合電子鼻雷達圖（圖2B）結果可知，發酵前后揮發性香氣成分差異主要體現在傳感器W2W、W1W、W1S、W5C、W3C和W1C，經發酵后的黑木耳多糖芳香族化合物、有機硫化物、無機硫化合物、萜烯類化合物和碳氫化合物香氣成分增加，芳香烴類化合物、氨類化合物和短鏈烷烴芳香化合物香氣成分減少，而在其余傳感器響應值基本匯于一點，說明它們對應香氣特征物質較為相似。含硫化合物和烴類化合物作為食用菌常見的揮發性物質，對食用菌的風味形成有很大影響，兩者與其他風味物質互補調和，呈現食用菌的特殊香氣[21]，而這2類化合物香氣成分含量在發酵后上升，說明冠突散囊菌發酵能改善黑木耳多糖的香氣成分。

圖2 多糖樣品電子鼻主成分分析（A）和雷達圖（B）

2.2 黑木耳發酵多糖添加量對酸奶乳酸菌活菌數的影響

乳酸菌能夠調節機體胃腸道正常菌群，保持微生物平衡，提高食物的消化率和生物價，降低血清膽固醇和體內毒素，抑制腸道腐敗菌的生長和腐敗物質的產生[22-23]。黑木耳發酵多糖添加量對酸奶乳酸菌活菌數的影響如圖3（A）所示。結果表明在酸奶發酵過程中添加黑木耳發酵多糖能促進乳酸菌的增殖，添加量達到1.0%時，酸奶的活菌數最高。添加量繼續增大，乳酸菌活菌數趨于平穩或呈下降趨勢，可能原因是過量的多糖導致發酵過程中體系的水分活度下降，影響乳酸菌的生長[24]。

圖3 黑木耳發酵多糖對酸奶乳酸菌活菌數（A）和持水量（B）的影響

2.3 黑木耳發酵多糖添加量對發酵酸奶持水力的影響

酸奶的持水力會影響酸奶的組織狀態、穩定性及口感。測定的酸奶持水力結果如圖3（B）所示。多糖添加量達到0.5%時，酸奶的持水力達到最大，說明適當的黑木耳發酵多糖能在發酵過程中與酪蛋白分子相互作用，強化蛋白質的網狀結構，可以容納水分和小分子物質，減少乳清的析出，從而增加酸奶的持水力，改善發酵乳的品質[25]。添加量大于1.0%時，酸奶的持水力開始顯著下降，說明過量的黑木耳發酵多糖會降低酸奶的持水力，可能是高濃度的多糖會破壞發酵乳凝膠的微觀結構從而導致水分流出和乳清的析出[26]。

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 黑木耳發酵多糖添加量對酸奶感官評分的影響

按照不同添加劑量添加黑木耳發酵多糖后，通過感官評定評價黑木耳發酵多糖對酸奶品質的影響，結果如圖4所示。隨著黑木耳發酵多糖添加量的增大，酸奶的顏色逐漸加深，黑木耳發酵多糖添加量達到2.0%時，酸奶組織狀態明顯下降，出現分層現象，可能是牛奶中的蛋白與多糖在發酵過程中發生美拉德反應，通過共價鍵連接在一起，形成共價絡合物，從而觀測到兩相，即高濃度高分子絡合物為一相，另一相是水[27]。根據圖4（B）感官評分結果顯示，黑木耳發酵多糖添加量0~1.0%時，隨著添加量增大，酸奶的感官評分呈現上升趨勢，添加量大于1.0%后，隨著添加量繼續增大，感官評分呈現下降趨勢，其中添加量1.0%時，酸奶色澤均勻、組織狀態細膩，發酵乳風味濃郁，伴隨黑木耳發酵多糖的獨特風味，口感良好，酸甜度適中。

圖4 黑木耳發酵多糖添加量對酸奶的感官影響

2.4.2 發酵時間對酸奶感官評分的影響

發酵時間對酸奶的感官評分的影響結果如圖5（A）所示。發酵時間為8和10 h時，感官評分最高。發酵時間短會造成發酵乳風味不夠濃郁，而發酵時間過長會使酸奶過酸。

2.4.3 白砂糖添加量對酸奶感官評分的影響

白砂糖添加量對酸奶感官評分的影響結果如圖5（B）所示。白砂糖添加量6.0%時，酸奶酸甜適中，感官評分最高，白砂糖添加量過低或過高會導致酸奶風味過酸或過甜。

圖5 發酵時間（A）和白砂糖添加量（B）對酸奶感官評分的影響

2.5 正交試驗結果與分析

黑木耳發酵多糖酸奶正交試驗結果如表4所示。根據極差R大小可知影響黑木耳發酵多糖酸奶的因素重要性順序：A＞C＞B，即影響最大的因素為黑木耳發酵多糖添加量，其次是白砂糖添加量，最后是發酵時間。由均值大小可知酸奶的最佳的工藝為黑木耳發酵多糖添加量1.0%，發酵時間9 h，白砂糖添加量8%。

表4 黑木耳發酵多糖酸奶正交試驗表

3 結論

試驗以黑木耳為原料，經冠突散囊菌發酵制備黑木耳發酵多糖，結果發現得到的黑木耳多糖香氣特征成分更加豐富；以乳酸菌活菌數、持水力、感官評分等指標，探討黑木耳發酵多糖對乳酸菌酸奶的發酵及其品質的影響，結果表明添加適量的黑木耳發酵多糖能促進乳酸菌的增殖，提高酸奶的持水力，增加酸奶的穩定性，并且改善酸奶的風味、口感、色澤及組織狀態；基于酸奶的乳酸菌活菌數、持水力及感官品質指標，通過單因素試驗和正交試驗確定黑木耳發酵多糖酸奶的最佳工藝：黑木耳發酵多糖添加量1.0%，發酵時間9 h，白砂糖添加量8%。新型黑木耳產品的研發有助于提升黑木耳的深加工水平，提高黑木耳的附加價值，有助于我國黑木耳產業步入轉型發展的新時期。