動(dòng)物源性成分分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

陳基耘

廣東省珠海市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所（珠海 519002）

近年來(lái)，食品安全問(wèn)題日益突出，不法分子利用廉價(jià)肉摻入高價(jià)肉中，從而獲取巨額利潤(rùn)。在我國(guó)，肉羊是畜牧業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一，消費(fèi)需求旺盛。然而，用雞、鴨和豬肉摻入或者替代羊肉的事件屢見(jiàn)不鮮。這些事件的出現(xiàn)嚴(yán)重干擾了我國(guó)畜肉產(chǎn)業(yè)，損害了消費(fèi)者的權(quán)益，制約了肉品質(zhì)量的提升甚至產(chǎn)生了宗教信仰相關(guān)的問(wèn)題。隨著不法商販的造假手段日益翻新，肉制品質(zhì)量安全的復(fù)雜性也逐漸增加，因此，傳統(tǒng)的鑒別技術(shù)已經(jīng)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)監(jiān)管的需求。準(zhǔn)確、高效、快速的多種動(dòng)物源性成分檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)，不僅能使消費(fèi)者的權(quán)益得到保障，也是監(jiān)管部門(mén)工作的技術(shù)支持。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)研究出多種檢測(cè)方法，常見(jiàn)的肉制品鑒別方法包括形態(tài)學(xué)、代謝組學(xué)、光譜學(xué)和基因組學(xué)方法等。形態(tài)學(xué)主要依賴(lài)光學(xué)顯微鏡技術(shù)和數(shù)據(jù)圖像分析像結(jié)合進(jìn)行鑒定；光譜學(xué)盡管分析速度較快，但是通常需要對(duì)大量樣品進(jìn)行建模，而且通用性不強(qiáng)；蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定技術(shù)包括電泳、化學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)方法等。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)容易受溫度、微生物污染、抗原交叉、反應(yīng)剪切力等多種因素影響，對(duì)儀器、試劑和樣品處理要求高，存在復(fù)雜、昂貴、費(fèi)時(shí)且缺乏特異性等問(wèn)題，因此，蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的可靠性和穩(wěn)定性較差，并不能很好地滿(mǎn)足摻假肉檢測(cè)的需求。近年來(lái)，以核酸分子鑒定技術(shù)為主的生物學(xué)鑒定方法由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為國(guó)際上肉類(lèi)源性成分鑒別的主流技術(shù)。核酸分子鑒定能夠克服蛋白鑒定方法的不足，具有基質(zhì)干擾小、易于操作和保存、鑒定成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，適宜在檢測(cè)機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用與推廣。因此，基于上述技術(shù)優(yōu)勢(shì)，文章對(duì)肉與肉制品中多種動(dòng)物源性成分鑒定相關(guān)技術(shù)進(jìn)行介紹并進(jìn)行展望，以期為監(jiān)管機(jī)構(gòu)、檢測(cè)機(jī)構(gòu)的肉與肉制品安全監(jiān)督提供技術(shù)參考。

1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)又稱(chēng)為聚合酶鏈技術(shù)（PCR），目前，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行多種動(dòng)物源性成分鑒定的常用PCR技術(shù)包括多重PCR[1-3]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[4-6]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR[7-9]等。這些技術(shù)主要是通過(guò)在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上加入熒光染料或標(biāo)記探針，根據(jù)熒光信號(hào)的累積對(duì)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，以實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的精確定量和定性分析。自2007年以來(lái)，我國(guó)也陸續(xù)頒布了一系列以PCR技術(shù)為主的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[10-13]，以滿(mǎn)足動(dòng)物源性成分鑒定的檢測(cè)和監(jiān)管需求。但是這些標(biāo)準(zhǔn)大多只用于定性鑒定，未進(jìn)行定量分析。

多重PCR技術(shù)，又稱(chēng)多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與一般PCR相同。如Iwobi等[14]選擇β-肌動(dòng)蛋白基因和肌肉生長(zhǎng)抑制素基因?yàn)榉治鰧?duì)象，設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，采用三重PCR用于定性和定量檢測(cè)混合肉中牛源性和豬源性成分。多重PCR技術(shù)因其靈敏度高、檢測(cè)效率高的特點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于多種動(dòng)物源性成分的同時(shí)鑒定，但該技術(shù)因在同一反應(yīng)中投入了多對(duì)引物，易引起交叉反應(yīng)。

熒光定量PCR技術(shù)，熒光試劑的使用包括熒光探針或者熒光染料。因所使用熒光試劑的不同，可分為特異類(lèi)和非特異類(lèi)兩類(lèi)。特異性檢測(cè)方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物。而非特異性檢測(cè)方法是在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射出熒光信號(hào)。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但后者則簡(jiǎn)便易行。這些技術(shù)亦被廣泛應(yīng)用于肉類(lèi)摻假的鑒定，Kang等[15]采用Subr Green染料，在100%~0.01%范圍內(nèi)對(duì)豬肉和牛肉混合樣品中豬肉的含量進(jìn)行測(cè)定，用于檢測(cè)牛肉加工制品中是否有豬肉摻假。

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCRRFLP）技術(shù)，是用特異設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增目標(biāo)材料時(shí)，由于特定位點(diǎn)的堿基突變、插入或缺失數(shù)很少，以至無(wú)多態(tài)出現(xiàn)，往往需要對(duì)相應(yīng)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切處理，以檢測(cè)其多態(tài)性。如Uddin等[16]建立了牛、水牛、雞、鴨、山羊、綿羊和豬的七重PCR-RFLP檢測(cè)方法，用于生鮮肉及加工肉制品中目標(biāo)物種的鑒別。然而，該技術(shù)使用內(nèi)切酶，這無(wú)形中增加了研究成本，限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

數(shù)字PCR是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。20世紀(jì)末，Vogelstein等[17]提出數(shù)字PCR的概念，通過(guò)將一個(gè)樣本稀釋并分成幾百到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含最多一個(gè)拷貝的DNA模板，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如Ren等[18]采用微滴數(shù)字PCR定量測(cè)定綿羊和山羊肉產(chǎn)品中雞肉的含量，并在檢驗(yàn)過(guò)程中將動(dòng)物源成分質(zhì)量比例轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)的比例，結(jié)果表現(xiàn)出良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的PCR、熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR在定量上不依賴(lài)擴(kuò)增閾值（Ct值），表現(xiàn)出更高的準(zhǔn)確度和靈敏度，但是該技術(shù)通常使用芯片完成，檢測(cè)成本偏高，試驗(yàn)對(duì)操作人員及設(shè)備環(huán)境的要求較高，因此難以在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)中普及。

2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是Notomi等[19]早在2000年建立的一種新型的等溫?cái)U(kuò)增方法。與傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）相比，LAMP技術(shù)可以在恒溫狀態(tài)下完成反應(yīng)而不需要在精密的控溫設(shè)備中對(duì)目標(biāo)模板進(jìn)行反復(fù)的熱變性，通常在0.5~1 h內(nèi)就可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列進(jìn)行109倍的連續(xù)快速擴(kuò)增。伴隨著DNA片段混合物的生成，大量的白色焦磷酸鎂沉淀生成，通過(guò)用SYBR green對(duì)DNA片段產(chǎn)物進(jìn)行熒光染色或者對(duì)焦磷酸鎂生成后溶液的濁度進(jìn)行分析，即可用肉眼或者儀器判斷樣本中是否含有目標(biāo)鏈。基于上述LAMP檢測(cè)技術(shù)原理的特殊性，該技術(shù)擺脫了復(fù)雜的精密儀器的限制，能滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及執(zhí)法的需求，結(jié)果肉眼可判別，因此被應(yīng)用于肉類(lèi)快速檢測(cè)中。如Cai等[20]研發(fā)了一種可在20 min內(nèi)檢測(cè)出肉制品中豬源成分的實(shí)時(shí)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的測(cè)定法，這也是首次應(yīng)用LAMP法檢測(cè)商業(yè)產(chǎn)品中的豬源成分。Zahradnik等[21]采用LAMP法檢測(cè)加工食品中馬肉含量，能從制備的香腸中檢測(cè)到0.1%的馬肉。

3 DNA分子雜交技術(shù)

DNA分子雜交的基礎(chǔ)是具有互補(bǔ)堿基序列的DNA分子，可以通過(guò)堿基對(duì)之間形成氫鍵等形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)。在進(jìn)行DNA分子雜交前，先要將兩種生物的DNA分子從細(xì)胞中提取出來(lái)，再通過(guò)加熱或提高pH的方法，將雙鏈DNA分子分離成為單鏈，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為變性。然后，將兩種生物的DNA單鏈放在一起雜交，其中一種生物的DNA單鏈?zhǔn)孪扔猛凰剡M(jìn)行標(biāo)記。如果兩種生物DNA分子之間存在互補(bǔ)的部分，就能形成雙鏈區(qū)。由于同位素被檢出的靈敏度高，即使兩種生物DNA分子之間形成百萬(wàn)分之一的雙鏈區(qū)，也能夠被檢出。這種技術(shù)很早就被應(yīng)用于肉類(lèi)檢測(cè)中，如Buntjer等[22]建立了牛、羊、馬、雞、豬等多種物種的分子雜交檢驗(yàn)方法，在混合肉中可以檢測(cè)到最低1%的目標(biāo)肉，并且對(duì)于熱加工的樣品依然具有很好的檢測(cè)效果。然而，該技術(shù)DNA雜交技術(shù)作為一種基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，也存在靈敏度低、耗時(shí)長(zhǎng)等缺陷。

4 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼技術(shù)是利用生物體DNA中一段保守片段對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的新興技術(shù)。DNA條形碼（DNA barcode）是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段。在發(fā)現(xiàn)一種未知物種或者物種的一部分時(shí)，研究人員便描繪其組織的DNA條形碼，而后與國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的其他條形碼進(jìn)行比對(duì)。如果與其中一個(gè)相匹配，研究人員便可確認(rèn)這種物種的身份。現(xiàn)今大部分動(dòng)物采用COI基因作為條形碼標(biāo)準(zhǔn)片段[23]。目前，基于DNA條形碼技術(shù)的研究主要集中在水產(chǎn)品鑒別領(lǐng)域，如：李新光等[24]利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)15種烤魚(yú)片進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有一種烤魚(yú)片與標(biāo)識(shí)相符，存在大量的造假行為；Carde?osa等[25]在廣州的市場(chǎng)上采購(gòu)了200種鯊魚(yú)魚(yú)鰭，這些魚(yú)鰭中只有0.5%含有完整的COI序列。

5 展望

隨著人民生活水平的提高，群眾對(duì)生活品質(zhì)特別是食品安全的關(guān)注一直是近年來(lái)的熱點(diǎn)。快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)肉類(lèi)源性成分，是我們迫切需要解決的問(wèn)題。基于分子生物學(xué)原理的檢測(cè)技術(shù)，因其低廉、高效、靈敏的優(yōu)勢(shì)，已成為目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域檢測(cè)的主流技術(shù)。但是，目前的檢測(cè)技術(shù)在精準(zhǔn)定量方面，效果仍不盡人意，難以解決有意摻假和無(wú)意摻假等執(zhí)法監(jiān)管難題。為此，針對(duì)以上窘?jīng)r，開(kāi)展針對(duì)性的研究，才能為科學(xué)執(zhí)法提供更準(zhǔn)確可靠的技術(shù)支持。

6 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)種類(lèi)豐富，其靈敏度高、特異性強(qiáng)及操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，自問(wèn)世以來(lái)倍受青睞，在檢測(cè)領(lǐng)域擁有很高的應(yīng)用價(jià)值。但基于分子生物學(xué)的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于肉類(lèi)摻假檢測(cè)領(lǐng)域仍存在一些挑戰(zhàn)。比如，熒光染料與DNA雙鏈的非特異性結(jié)合或者體系中存在與靶基因同源的序列都可能會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，新型熒光標(biāo)記物的設(shè)計(jì)及新型檢測(cè)模式的深入探索，在肉類(lèi)摻假檢測(cè)領(lǐng)域，快速準(zhǔn)確、低成本、高通量的檢測(cè)技術(shù)將指日可待。