竹葉花椒黃酮粗提液純化工藝及抗氧化性研究

周孟焦，何鑫柱, ，李朝俊, ，梁曉峰,

1. 四川中醫藥高等專科學校川西北中藥材資源研究與開發利用實驗室（綿陽 621010）；2. 西南科技大學材料與化學學院（綿陽 621010）

竹葉花椒（Zanthoxylum armatumDC），長期以來被認為是花椒的野生品種，與花椒相比，具有更多的風味成分，其活性成分豐富，藥理作用廣泛，可直接食用或以調料入味，或用于醫藥行業，隨著竹葉花椒種植面積的不斷增加，迫切需要拓寬竹葉花椒在其他行業的應用[1-4]。研究表明，竹葉花椒果皮中含有豐富的活性物質，黃酮含量在竹葉花椒活性物質中占比大，具有抗氧化[5]、抑菌[6]、抗衰老[7]、免疫調節[8]等多種藥理作用。從竹葉花椒中提取天然黃酮類化合物有助于提高對其藥用價值的認識，對高效開發竹葉花椒資源的轉化利用具有重要意義。

聚酰胺樹脂和大孔吸附樹脂被廣泛應用于黃酮類物質的純化精制。聚酰胺樹脂富含酰胺基團，分離和脫色效果好。大孔吸附樹脂為網狀結構，性質穩定、吸附容量大。二者吸附機理決定其對活性物質的純化方面存在差異，將其聯用可充分發揮兩者優勢，提供一種高效的純化方法[9-12]。

試驗以蘆丁為對照品，利用分光光度法測定純化后樣品的總黃酮含量；研究聚酰胺和大孔吸附樹脂對竹葉花椒黃酮的吸附和解吸能力，在單因素試驗基礎上利用響應面試驗優化聚酰胺-大孔吸附樹脂聯用純化黃酮的工藝參數，并對其體外抗氧化活性進行初步評價，以期為竹葉花椒黃酮的深入研究和開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹葉花椒（產地四川綿陽，干燥備用）。

蘆丁（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；聚酰胺（0.250~0.600 mm，即30~60目，D101大孔吸附樹脂，上海麥克林生化科技股份有限公司）；無水乙醇（分析純，成都科隆化學品有限公司）。

1.2 儀器與設備

XH-MC-1型實驗室微波合成儀（北京祥鵠科技發展有限公司）；BSA124S電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；UV-315紫外可見分光光度計（日本島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 竹葉花椒黃酮粗提液的制備

取適量干燥竹葉花椒，乙醇溶液為提取溶劑，放入實驗室微波合成儀中，設置提取條件，石油醚除去脂溶性雜質，即得竹葉花椒粗提液。

精密量取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL 0.2 mg/mL的蘆丁溶液于7支試管中，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[13]，在510 nm處對竹葉花椒提取物含量進行測定。得到蘆丁標準曲線線性回歸方程A=0.79C+ 0.001 57，R2=0.999 6。

1.3.2 樹脂預處理

1.3.2.1 聚酰胺預處理

將聚酰胺在95%乙醇中攪拌10 h，洗去乙醇后在5 mol/L氫氧化鈉中攪拌5 h，水洗至流出液pH 7，在5 mol/L醋酸溶液中攪拌5 h，水洗至流出液pH 7[14]。

1.3.2.2 大孔吸附樹脂預處理

將大孔吸附樹脂在95%乙醇攪拌24 h，洗去乙醇后在5%氫氧化鈉溶液中攪拌24 h，水洗至流出液pH 7，經5%鹽酸溶液攪拌24 h，水洗至流出液pH 7[15]。

1.3.3 單因素試驗

在層析柱中加入一定比例的聚酰胺和大孔吸附樹脂，以蒸餾水為填充溶劑，精密量取一定濃度的竹葉花椒黃酮提取液加入層析柱中，水洗，以一定體積分數的乙醇為洗脫液，設置洗脫條件，收集洗脫液，測定流出液吸光度，計算黃酮濃度，按（1）和（2）計算樹脂的吸附率和解吸率。

式中：Q為樹脂吸附量，mg/g；C0為竹葉花椒黃酮粗提液質量濃度，mg/mL；C1為經樹脂吸附后乙醇中黃酮質量濃度，mg/mL；M為樹脂質量，g；C2為乙醇溶液中竹葉花椒黃酮濃度，mg/mL；V1為乙醇溶液體積，mL。

聚酰胺-大孔吸附樹脂聯用法的單因素試驗設計見表1。

表1 單因素試驗條件

1.3.4 響應面試驗

響應面試驗的因素和水平見表2。

表2 響應面因素水平表

1.3.5 竹葉花椒黃酮體外抗氧化活性研究

按文獻[3]的方法，以蘆丁和維生素C為陽性對照，取2 mL不同濃度的竹葉花椒黃酮提取液和2 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液，混勻，黑暗下反應30 min，在517 nm處測定吸光度；以蘆丁和維生素C為陽性對照，取2 mL不同濃度的竹葉花椒黃酮提取液和2 mL ABTS溶液，混勻，靜置6 min，在734 nm處測定吸光度。根據式（3）計算提取液對自由基清除率。

式中：A0為2 mL無水乙醇+2 mL自由基溶液的吸光度；A1為2 mL竹葉花椒提取液+2 mL自由基溶液的吸光度；A2為2 mL竹葉花椒提取液+2 mL無水乙醇的吸光度。

2 結果與分析

2.1 竹葉花椒黃酮粗提液純化的單因素試驗

2.1.1 聚酰胺與大孔吸附樹脂用量比的選擇

由表3可知，由于聚酰胺與大孔吸附樹脂的結構與性質存在差異，不同樹脂用量比對有效成分吸附具有影響，樹脂用量比3︰5（g/g）時，樹脂對總黃酮的吸附率最高。故選擇3︰5（g/g）為竹葉花椒富集純化的最佳樹脂用量比。

表3 聚酰胺與大孔吸附樹脂用量比對吸附率的影響

2.1.2 竹葉花椒黃酮粗提液的質量濃度的選擇

由圖1可知：在1~6 mg/mL質量濃度范圍內，隨著濃度增加，吸附率上升較快，吸附率在上竹葉花椒黃酮粗提液質量濃度達到6 mg/mL時，可達80.67%，濃度繼續增加時，總黃酮在樹脂中的因黏度過大而擴散緩慢，雜質在樹脂上的吸附增加，同時也會超過樹脂的飽和吸附量，使總黃酮得不到充分的吸收，而造成部分黃酮的損失。故選擇6 mg/mL為竹葉花椒黃酮粗提液富集純化的質量濃度。

圖1 竹葉花椒黃酮粗提液的濃度對吸附率的影響

2.1.3 竹葉花椒黃酮粗提液流速的選擇

由圖2可知：竹葉花椒黃酮粗提液流速1.5 mL/min時，樹脂吸附率為78.41%，流速繼續增加時，樹脂吸附率反而降低。流速比較慢時，樹脂上的活性位點能充分吸附黃酮，但會降低樹脂的吸附效率。流速太快，總黃酮與樹脂表面活性部位相互作用時間過短，黃酮還未被樹脂充分吸附就會隨著溶液，造成損失。故選擇1.5 mL/min為竹葉花椒黃酮粗提液富集純化的流速。

圖2 竹葉花椒黃酮粗提液流速對吸附率的影響

2.1.4 樹脂洗脫溶劑的選擇

由圖3可知：樹脂洗脫溶劑濃度在20%~60%范圍內，樹脂對黃酮的解吸率增加明顯，解吸率在乙醇體積分數60%時，可達86.67%，隨著濃度繼續增加，樹脂的解吸率開始降低。可能是因為竹葉花椒黃酮粗提液為混合物，目標物更多地溶于60%乙醇溶液而容易被洗脫下來，乙醇體積分數再增加，雜質在高體積分數乙醇中溶解增加隨乙醇而流出，故選擇體積分數60%乙醇為竹葉花椒富集純化的洗脫溶劑。

圖3 樹脂洗脫溶劑濃度對解吸率的影響

2.1.5 乙醇溶液流速的選擇

由圖4可知：乙醇溶液流速在0.5~2 mL/min范圍內，樹脂的解吸率比較穩定，洗脫流速2 mL/min時，樹脂的解吸率可達77.66%，能將總黃酮較多地洗脫下來，洗脫流速大于2 mL/min，乙醇與黃酮接觸不充分就開始流出，大多數黃酮仍吸附在樹脂上，降低樹脂的洗脫率，故乙醇溶液流速選擇2 mL/min。

圖4 乙醇溶液流速對解吸率的影響

2.1.6 乙醇溶液收集量的選擇

由圖5可知：乙醇溶液收集量在2.5~4 BV范圍內，樹脂解吸率隨收集量的增加而提高較快，收集量達到4 BV時，樹脂解吸率可達86.16%，超過4 BV時解吸率反而降低。可能是因為洗脫液用量較少時，不能將樹脂上的黃酮完全洗脫下來，收集量達到4 BV時，能較多地將黃酮洗脫下來，但乙醇溶液收集量再增加，會將雜質一同洗出，同時也造成洗脫劑的浪費，故乙醇溶液收集量選擇4 BV。

圖5 乙醇溶液收集量對解吸率的影響

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果與回歸分析

表4的試驗結果數據利用Design-Expert 8.05軟件對進行統計分析，得到的回歸方程為：總黃酮含量Y=86.41-1.70A+1.04B-0.78C+0.26AB+0.56AC-0.052BC- 7.79A2-4.63B2-0.62C2。式中：Y為總黃酮含量；A為樹脂用量比，g/g；B為樹脂洗脫溶劑，mg/mL；C為乙醇溶液收集量，BV。

表4 響應面試驗設計及結果

由表5可知：模型P＜0.001，試驗模型極顯著，失擬項P=0.385 3，失擬項不顯著，模型的決定系數R2=0.994 8，說明方程回歸效果好，校正決定系數Radj2=0.988 2，表明模型是可靠的，用該模型分析和預測竹葉花椒總黃酮含量可靠。由F值判斷，3個因素影響竹葉花椒總黃酮含量的順序為A（樹脂用量比）＞B（樹脂洗脫溶劑）＞C（乙醇溶液收集量）。

表5 方差分析

2.2.2 響應面曲線分析

觀察響應面可直觀得到變量間交互作用的顯著程度，由圖6可知，樹脂用量比和乙醇溶液收集量的交互作用對總黃酮含量的影響最大，樹脂用量比和樹脂洗脫溶劑的體積分數的交互作用對總黃酮含量的影響次之，樹脂洗脫溶劑的體積分數和乙醇溶液收集量的交互作用對總黃酮含量的影響最小。

圖6 兩因素交互作用對竹葉花椒總黃酮含量影響的響應曲面（左）和等高線圖（右）

2.2.3 驗證試驗結果分析

在PA與MAR用量比3︰5（g/g）、樹脂洗脫溶劑60%、乙醇溶液收集量4.5 BV、其他條件不變的條件下，設置3組平行試驗，總黃酮平均含量為87.35%，含量基本穩定，表明該回歸模型具有可靠性。

2.3 竹葉花椒黃酮體外抗氧化活性分析

由圖7可知，在試驗濃度范圍內，3種物質清除自由基的能力與自身的質量濃度呈正相關，樣品質量濃度較低時對自由基的清除能力不明顯，隨著質量濃度的增加，其所對應的自由基清除能力也增加。在同一濃度下，各組分對自由基清除率的順序依次為維生素C＞純化黃酮＞未純化黃酮。由此可見竹葉花椒黃酮提取物對DPPH和ABTS自由基的清除能力較強。

圖7 竹葉花椒總黃酮對DPPH自由基（上）、ABTS自由基清除能力（下）

3 結論

確定以聚酰胺-大孔吸附樹脂聯用純化竹葉花椒黃酮粗提液的最佳工藝參數：聚酰胺與大孔吸附樹脂用量比3︰5（g/g）、竹葉花椒黃酮粗提液的質量濃度6 mg/mL、竹葉花椒黃酮粗提液的流速1.5 mL/min、60%乙醇作為樹脂洗脫溶劑、乙醇溶液流速2 mL/min、乙醇溶液收集量4 BV，在此條件下總黃酮平均含量為87.35%。聚酰胺、大孔吸附樹脂聯用對竹葉花椒黃酮類物質有較好的吸附和解吸作用，能夠明顯減少提取液中雜質，使有效成分含量增多。竹葉花椒黃酮的抗氧化活性雖然低于維生素C，但在一定濃度下具有抗氧化活性，純化后黃酮抗氧化活性優于純化前黃酮。后續將進一步研究竹葉花椒黃酮相關指紋圖譜、抗氧化性能及其譜效關系，揭示影響其抗氧化性的分子機理，為竹葉花椒的綜合開發與利用提供理論支撐。