長莖葡萄蕨藻多酚提取工藝優化及其抗氧化性測定

牛生洋，劉強，李波，童艷梅，陳秀荔，趙永貞

1. 河南科技學院食品（新鄉 453003）；2. 廣西壯族自治區水產科學研究院廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室（南寧 530021）

長莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）又名“海葡萄”，是廣泛分布于熱帶、亞熱帶海域的一種暖溫性大型經濟綠藻[1]。其富含多糖、多酚類、氨基酸、不飽和脂肪酸、無機鹽等營養成分，且比普通藻類、蔬菜類所含營養成分總量和種類都更高[2-3]。有人稱長莖葡萄蕨藻在食用時口感如魚子醬一般豐富，因此又有“綠色魚子醬”之稱[4-6]，常蘸醬調味生食、搭配海鮮涼拌，或制成高級料理。長莖葡萄蕨藻由于其安全性高，目前已經成為保健食品、藥物及化妝品等領域的研究熱點，在保健品市場擁有廣闊的開發前景[7-8]。

研究表明，海藻中生物活性物質主要是海藻多酚，其是一類廣泛存在于藻類體內的間苯三酚衍生物，可保護海藻自身免受植食性動物干擾，具有多種生物學活性[9]，尤其是抗氧化活性[10-11]。有報道指出，海藻能暴露于產生自由基和氧化劑環境中生長，就是因為其具有強大的抗氧化系統，如來自加拿大的掌狀紅皮藻[12]、馬來西亞的總狀蕨藻和匍枝馬尾藻，以及法國的雙歧藻和歐囊鏈藻[13]。然而，關于長莖葡萄蕨藻是否具有相同的生物活性物質卻鮮有報道。

近年來，長莖葡萄蕨藻在我國近海漁區繁殖迅速，如果不加限制，將嚴重影響我國漁業生產。此次研究通過響應面法優化長莖葡萄蕨藻多酚常規提取工藝，并對其抗氧化活性進行檢測，以期為長莖葡萄蕨藻的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長莖葡萄蕨藻采于廣西省防城港市國家級廣西SPF南美白對蝦良種場；ABTS標準品、沒食子酸標品、茶多酚標品、水楊酸（北京索萊寶科技有限公司）；過硫酸鉀、福林-酚試劑（上海麥克林生化有限公司）；無水乙醇（天津市大茂化學試劑廠）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水碳酸鈉（天津市紅巖化學試劑廠）；1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）（上海化成工業發展有限公司）；硫酸亞鐵（天津市科密歐化學試劑有限公司）；30%過氧化氫（成都金山化學試劑有限公司）。

1.2 試驗儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；AR1140分析天平（深圳市時代之峰科技有限公司）；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；G9800A酶標儀（美國Thermol公司）；多功能粉碎機JR-200（永康市松青五金廠）；H2050R臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 材料預處理

將長莖葡萄蕨藻洗凈，于55 ℃烘干粉碎，過0.425 mm篩，置于干燥皿中備用。

1.3.2 長莖葡萄蕨藻多酚的提取

稱取1 g長莖葡萄蕨藻粉末，在一定的料液比、乙醇體積分數、水浴溫度和水浴時間下進行長莖葡萄蕨藻多酚的提取，在5 500 r/min，4 ℃條件下離心10 min，取上清液旋轉蒸發，濾液用乙醇定容至100 mL容量瓶中，即得長莖葡萄蕨藻多酚提取液。

1.3.3 標準曲線的繪制

將質量濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液分別加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL于10 mL的試管中，加入0.5 mL的福林-酚顯色，5 min后加入2 mL的7.5 g/L的碳酸鈉溶液，用水定容至10 mL搖勻后在暗處反應1 h，在760 nm波長下測吸光度。以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標建立標準曲線[14]。如圖1所示，標準曲線回歸方程為Y=0.115 59X+0.121 7，R2=0.999 7。

圖1 沒食子酸標準曲線

1.3.4 長莖葡萄蕨藻多酚提取率

用1 mL長莖葡萄蕨藻多酚代替沒食子酸，余下步驟同上；通過回歸方程，可得長莖葡萄蕨藻多酚質量濃度，通過式（1）可得長莖葡萄蕨藻多酚提取率。

式中：W為長莖葡萄蕨藻多酚提取率，mg/g；C為多酚質量濃度，mg/mL；V為多酚體積，mL；N為稀釋倍數；w為長莖葡萄蕨藻粉末質量，g。

1.3.5 單因素試驗

選取了溶劑種類、溶劑濃度、水浴時間、水浴溫度、水浴次數、料液比6個單因素進行試驗，根據6個因素對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響程度，最終以溶劑濃度、料液比、水浴時間和水浴溫度四個因素做單因素試驗[15-16]。

1.3.5.1 乙醇體積分數對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

取5份1 g長莖葡萄蕨藻粉末，固定料液比1∶40 g/mL、水浴溫度70 ℃、水浴時間60 min，考察乙醇體積分數40%，50%，60%，70%和80%對多酚提取率的影響。

1.3.5.2 料液比對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

取5份1 g長莖葡萄蕨藻粉末，固定乙醇體積分數70%、水浴溫度70 ℃、水浴時間60 min，考察料液比1∶30，1∶35，1∶40，1∶45和1∶50 g/mL對多酚提取率的影響。

1.3.5.3 水浴時間對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

取5份1 g長莖葡萄蕨藻粉末，固定料液比1∶40 g/mL、乙醇體積分數70%、水浴溫度70 ℃，考察水浴時間30，40，50，60和70 min對多酚提取率的影響。

1.3.5.4 水浴溫度對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

取5份1 g長莖葡萄蕨藻粉末，固定料液比1∶40 g/mL、乙醇體積分數70%、水浴時間60 min，考察水浴溫度60，65，70，75和80 ℃對多酚提取率的影響。

1.3.6 響應面優化試驗

使用Design-Expert 8.0.6軟件進行試驗設計，以單因素試驗為基礎，乙醇體積分數、料液比、水浴時間和水浴溫度為自變量，長莖葡萄蕨藻多酚的提取率為響應值，對長莖葡萄蕨藻多酚的提取工藝進行優化，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平

1.3.7 長莖葡萄蕨藻多酚粗提物抗氧化性能測定

1.3.7.1 清除DPPH自由基能力的測定

在試管中加入2 mL新鮮配制的0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，然后加入1.5 mL不同濃度梯度的長莖葡萄蕨藻多酚提取液，混勻后暗室反應0.5 h，在517 nm處測其吸光度A1；溶劑水代替樣品的吸光度為A3；用無水乙醇替代DPPH·乙醇溶液測吸光度A2，重復3次。以茶多酚作為陽性對照，按式（2）計算DPPH自由基清除率[17-18]。

1.3.7.2 清除羥自由基能力的測定

參照范三紅等[19]的方法：首先配制9 mmol/L的水楊酸、9 mmol/L的FeSO4和8.8 mmol/L的H2O2。在試管中加入2 mL的長莖葡萄蕨藻多酚，再加入水楊酸和FeSO4各1 mL，最后加2 mL的H2O2混勻，于37 ℃水浴0.5 h，在510 nm處測吸光度A1；用同體積的水代替長莖葡萄蕨藻多酚，測其吸光度A2；用同體積的水代替H2O2，測其吸光度A3。以茶多酚作為陽性對照，按式（3）計算羥自由基清除率。

1.3.7.3 清除ABTS自由基能力的測定

參照Cristina等[20]的方法：首先配制ABTS儲備液、7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液，等體積混合避光室溫放置15 h，然后在734 nm下用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液將ABTS儲備液的吸光度調為0.70左右，記為A1。將0.20 mL不同濃度的樣品溶液與2 mL的ABTS稀釋液混合于室溫反應6 min后測定734 nm處的吸光度A2。按式（4）計算ABTS自由基清除率。

1.3.8 數據處理

試驗數據采用SAS（9.1）進行統計分析，Origin 8.6（USA）作圖。最后用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面試驗數據進行處理。

2 試驗結果

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分數的升高，長莖葡萄蕨藻多酚的提取率先升高后降低，最大值為0.548 2 mg/g。當乙醇體積分數大于60%后，由于極性作用會導致多酚與乙醇間的相互作用力減弱，進而使多酚提取率減小，再者，高濃度溶劑也增加了工業生產的成本，因此選取60%為乙醇提取體積分數。

圖2 乙醇體積分數對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

2.1.2 料液比對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

由圖3可知，隨著料液比中液體占比的升高，長莖葡萄蕨藻多酚的提取率先升高后趨于穩定，在料液比1∶40 g/mL時多酚提取率達到最大值0.482 2 mg/g，之后差異不大，在節約成本的原則上，料液比選擇1∶40 g/mL。

圖3 料液比對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

2.1.3 提取溫度對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，長莖葡萄蕨藻多酚的提取率先升高后降低，在提取溫度70 ℃時達到最大值0.513 2 mg/g，之后多酚的提取率開始下降。水浴溫度超過70 ℃，會使一部分不耐高溫的多酚分解，反而降低了提取率。因此選擇70 ℃的水浴溫度為提取溫度。

圖4 提取溫度對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

2.1.4 水浴時間對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

由圖5可知，隨著水浴時間的延長，長莖葡萄蕨藻多酚的提取率先升高后降低，在水浴時間50 min時多酚提取率達到最大值0.536 8 mg/g，之后隨著水浴時間的增加，多酚的提取率開始下降。隨著水浴時間增加，提取出來的多酚開始氧化，導致多酚提取率下降。因此選擇50 min水浴時間為提取時間。

圖5 水浴時間對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

2.2 響應面法優化提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計與結果

以單因素試驗為基礎，乙醇體積分數、料液比、水浴時間和水浴溫度為自變量，長莖葡萄蕨藻多酚的提取率為響應值，對長莖葡萄蕨藻多酚的提取工藝進行優化。響應面法的試驗設計與結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果

用Design-Expert 8.0.6軟件對所得試驗數據進行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：

Y=0.62+0.055A+0.003 133B+0.004 108C+0.002 042D+ 0.004 15AB-0.000 875AC+0.001 875AD-0.001 025BC-0.000 375BD+0.000 375CD-0.13A2-0.14B2-0.15C2-0.15D2

2.2.2 方差分析

對所得數據進行統計學分析，結果見表3：模型P＜0.000 1，說明模型差異高度顯著，方程的失擬誤差（P=0.256 7＞0.05）不顯著，表明該回歸模型對試驗結果擬合較好，試驗誤差較小，故可用此模型對長莖葡萄蕨藻多酚提取工藝進行分析和預測。

表3 回歸模型的方差分析

在試驗中，一次項A對長莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響達到極顯著水平（P＜0.01），C達到顯著水平（P＜0.05），B和D為不顯著。交互項均為不顯著，二次項A2、B2、C2、D2均為極顯著，各試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。根據顯著性P值的大小可得到各因素對多酚提取率影響的順序：乙醇體積分數（A）＞水浴溫度（C）＞料液比（B）＞水浴時間（D）。

2.2.3 響應面法模型分析

響應面的陡峭程度和等高線的稀疏可以反映兩個變量之間相互作用程度，響應面越陡峭，等高線越密，說明二者之間的相互作用越好[13,15]。由圖6可知，乙醇體積分數與料液比（圖6A）、乙醇體積分數與水浴時間（圖6B）及料液比與水浴溫度（圖6C）的響應面曲線陡峭等高線明顯，說明它們對長莖葡萄蕨藻總多酚含量的交互效應顯著。

圖6 多酚提取率影響的響應曲面及等高線圖

2.2.4 最佳工藝預測及結果驗證

通過Desige-Expert 8.0.6軟件分析得到長莖葡萄蕨藻多酚提取的最佳工藝條件：乙醇體積分數60%、料液比1∶40 g/mL、提取溫度70 ℃、提取時間50 min，重復3次驗證該結果，得出長莖葡萄蕨藻多酚的提取率為0.632 9±0.021 mg/g，與預測值0.641 3 mg/g接近，說明該模型擬合程度較好。

2.3 長莖葡萄蕨藻多酚粗提物的抗氧化性

2.3.1 長莖葡萄蕨藻多酚粗提物清除DPPH自由基能力

長莖葡萄蕨藻多酚對DPPH自由基清除能力的結果如圖7所示。隨著濃度的增加，長莖葡萄蕨藻多酚對DPPH自由基的清除效果也增加，在質量濃度為120 μg/mL時，清除率達到52.81%，茶多酚在質量濃度120 μg/mL時，清除率達到91.82%。茶多酚具有活潑的羥基氫，會與DPPH自由基結合，而長莖葡萄蕨藻多酚里的羥基氫較少，所以在相同濃度下茶多酚清除DPPH自由基的能力更強。

圖7 長莖葡萄蕨藻多酚清除DPPH自由基的性能

2.3.2 長莖葡萄蕨藻多酚粗提物清除羥自由基

長莖葡萄蕨藻多酚對羥自由基清除能力的結果如圖8所示。長莖葡萄蕨藻多酚在低濃度時就表現出比較強的清除羥自由基的能力。在質量濃度為20 μg/mL時，長莖葡萄蕨藻多酚清除率就達到76.91%，茶多酚為47.21%；在質量濃度120 μg/mL時，長莖葡萄蕨藻多酚清除率為92.26%，茶多酚為85.72%，說明長莖葡萄蕨藻多酚具有良好的清除羥自由基的能力。

圖8 長莖葡萄蕨藻多酚清除羥自由基的性能

2.3.3 長莖葡萄蕨藻多酚粗提物清除ABTS自由基

長莖葡萄蕨藻多酚對ABTS自由基清除能力的結果如圖9所示。長莖葡萄蕨藻多酚在低濃度時就表現出比較強的清除ABTS自由基的能力。在質量濃度為20 μg/mL時，長莖葡萄蕨藻多酚清除率就達到68.56%，茶多酚為22.34%；在質量濃度120 μg/mL時，長莖葡萄蕨藻多酚清除率為98.04%，茶多酚為89.51%，說明長莖葡萄蕨藻多酚具有良好的清除ABTS自由基的能力。

圖9 長莖葡萄蕨藻多酚清除ABTS自由基的性能

3 結論

通過響應面試驗優化長莖葡萄蕨藻多酚的提取工藝，最佳條件為乙醇體積分數60%、料液比1∶40 g/mL、提取溫度70 ℃、提取時間50 min，在此條件下長莖葡萄蕨藻多酚的提取率為0.632 9±0.021 mg/g。長莖葡萄蕨藻多酚對DPPH自由基的清除率低于茶多酚，對羥自由基和ABTS自由基的清除率明顯高于茶多酚；在低濃度（20 μg/mL）下長莖葡萄蕨藻多酚對羥基自由基和ABTS自由基清除率分別為76.91%和68.56%，均高于茶多酚的47.21%和22.34%，說明長莖葡萄蕨藻多酚具有良好的抗氧化性，為以后分析其生物活性奠定了基礎。