2種方法檢測乳粉中三聚氰胺的探討及改進

劉超，景贊，呂雪梅

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

三聚氰胺，又稱為密胺或蛋白精，分子式C3N3H6，含氮量達66.67%[1]，是一種白色晶體，熔點為354 ℃，在水、乙二醇和甘油中基本不溶解，微溶于乙醇[2]。三聚氰胺是一種化工原料，在乳粉中限值為2.5 mg/kg。經典的凱氏定氮法原理是檢測乳粉中的含氮量，進而換算出乳粉中的蛋白質。這種方法存在漏洞，一些不法商家利用氮與蛋白質的這種含量關系，將三聚氰胺人為摻進乳粉，從而造成乳粉中蛋白質含量高的假象。過量攝入三聚氰胺導致腎臟內形成不溶性結晶，導致嬰兒的腎功能衰竭甚至死亡。因此檢測乳粉中三聚氰胺很有必要[3]。

檢測三聚氰胺的方法很多，高效液相色譜（HPLC）法[4-6]、液相色譜-質譜/質譜（LC-MS/MS）法[7-11]、氣相色譜-質譜聯用（GC-MS/MS）法均適合乳粉中三聚氰胺含量的測定。其中，HPLC法是測定三聚氰胺較為常用的方法，一般與紫外檢測器和二級管陣列檢測器聯用，但其靈敏度和選擇性均低于質譜檢測器[12]。試驗用GB/T 22388—2008中第一法高效液相色譜法、第二法液相色譜-質譜/質譜法分別測定同一樣品中的三聚氰胺含量[13]，同時測定樣品加標回收率，找出2種方法的不足，并提出2種方法的優化措施。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

DGU-20A高效液相色譜儀（島津國際貿易有限公司）；ME104E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DGU20A-API4500液質聯用儀（美國AB SCIEX公司）；HT190R高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；JC-GX-24固相萃取儀（聚創華葉儀器實力有限公司）；KQ3200E超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；HSC-12A氮吹儀（北京佳航博創科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

三聚氰胺標準品（99.0%，Lot：G133044，Dr. Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺內標標準品（Melamine- 13 C3，100 μg/mL，CAS號1173022-88-2）；三聚氰胺質控樣（3.82±0.70 mg/kg，TF01580051）；甲醇、乙腈、乙酸銨（均為色譜純）；辛烷磺酸鈉、乙酸銨、乙酸（均為優級純）；氨水（25%~28%）、三氯乙酸、檸檬酸，均為分析純；乳粉（雀巢高鈣營養奶粉）。

1.3 樣品處理（高效液相色譜法、液相色譜-質譜/質譜法）

樣品處理見GB/T 22388—2008第一法高效液相色譜法、第二法液相色譜-質譜/質譜法。

1.4 液相色譜法的測定條件

色譜柱CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為離子對試劑緩沖液（檸檬酸、辛烷磺酸鈉，pH 3）與乙腈（90︰10，V/V）；流速0.8 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長240 nm；進樣體積10 μL。

1.5 液相色譜-質譜/質譜法檢測條件

1.5.1 液相條件

色譜柱為強陽離子交換與C18混合填料，混合比例（1︰4，150 mm×2.0 mm，5 μm）；流動相為乙酸銨溶液與乙腈（1︰1，V/V），乙酸調至pH 3；進樣體積10 μL；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min。

1.5.2 質譜條件

掃描方式ESI+；離子噴霧電壓4 500 V；霧化氣為氮氣，30 ps；干燥氣為氮氣，30 psi；離子化溫度450 ℃。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

2.1.1 高效液相色譜法

準確稱取10 mg三聚氰胺標準品于10 mL容量瓶中，用1︰1的甲醇水（V/V）溶解并定容，配制成1 mg/mL的標準儲備液，在4 ℃下避光保存。用流動相將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋配制成系列濃度為0.4，0.8，1.0，5.0和10.0 μg/mL的標準工作液，按1.4的條件進行檢測，以峰面積為縱坐標，三聚氰胺濃度為橫坐標，繪制標準曲線，見表1。

2.1.2 液相色譜-質譜/質譜外標法

取空白樣品按1.3的液相色譜-質譜/質譜法處理，所得溶液用作2.1.1中三聚氰胺標準儲備液的稀釋液，配制一系列濃度范圍為60~540 ng/mL標準工作液，按1.5的條件檢測，以峰面積為縱坐標，三聚氰胺濃度為橫坐標，繪制標準曲線，見表1。

2.1.3 液相色譜-質譜/質譜內標法

分別取適量三聚氰胺中間液，加入適量三聚氰胺內標液，用1︰1的甲醇水（V/V）溶液定容至10 mL，配制一系列濃度范圍為60~540 ng/mL標準工作液，內標濃度為20 ng/mL。以三聚氰胺與內標物峰面積比為縱坐標，三聚氰胺濃度為橫坐標，繪制標準曲線，見表1。

由表1可知：液相色譜法的三聚氰胺在0.4~10.0 μg/mL濃度范圍內的線性關系為y=69 824x+16 359，r=0.999 9；液相色譜-質譜/質譜法三聚氰胺在60~540 ng/mL濃度范圍內的線性關系為y=51.189x+562.61，r=0.997 3；內標法的三聚氰胺在60~540 ng/mL濃度范圍內的線性關系為y=0.049 5x+0.289 5，r=0.999 1。3種方法的線性關系較好，均可用于三聚氰胺的準確定量分析。

表1 不同定量方法的校準曲線

2.2 液相色譜法測定乳粉中三聚氰胺的含量

現有已知三聚氰胺含量的乳粉質控樣，三聚氰胺含量為3.82±0.7 mg/kg，采用GB/T 22388—2008第一法高效液相色譜法檢測，計算回收率，所得結果見表2。

由表2可知：液相色譜法測定乳粉質控樣計算結果未在指定范圍且回收率為81.4%；加標回收試驗的回收率為83.1%，兩者的回收率均在80%左右，說明完全按國標中液相色譜法檢測三聚氰胺，無論質控樣還是隨行加標樣均存在回收率較低的問題。可能的原因是在檢測中存在提取不完全、先過濾后定容等不完善的步驟。

表2 液相色譜法測定三聚氰胺的結果

2.3 液質聯用法測定乳粉中三聚氰胺的含量

為探究前處理、基質效應對測定結果的影響，對上述乳粉質控樣及隨行加標樣均按照1.3中液質聯用法的步驟進行前處理，所得溶液分別按1.5的條件測定，標準曲線定量計算，三聚氰胺的檢測結果見表3。

表3 液質聯用法測定三聚氰胺的結果

結果表明，液質聯用法測定乳粉質控樣及加標回收試驗的回收率分別為82.7%和81.3%，回收率均在同一水平，說明按國標中液質聯用法測定三聚氰胺，無論質控樣還是加標樣均存在回收率較低的問題。可能的原因是樣品存在基質效應，雖然采取基質配標的方法消除，但只是降低基質效應的影響，未徹底消除。

2.4 液相色譜法的改進

2.4.1 液相色譜柱的選用

GB/T 22388—2008高效液相色譜法中只規定液相色譜柱為C18色譜柱，但在試驗中，三聚氰胺目標峰附近會出現三聚氰酸的雜質峰，嘗試不同廠家生產的相同規格的液相色譜柱，僅資生堂和沃特世的液相色譜柱能完全分開三聚氰胺和三聚氰酸，建議使用這2個廠家的液相色譜柱。

2.4.2 超聲時間和提取次數的優化

GB/T 22388—2008高效液相色譜法中三聚氰胺的提取次數和超聲次數均為1次，且超聲時間僅為10 min。但在試驗中，10 min的超聲時間不足以完全將三聚氰胺提取出來。而且，提取次數1次勢必殘留部分三聚氰胺在殘渣中，導致回收率偏低。方法優化為：準確稱取2 g乳粉于離心管中，用12 mL三氯乙酸溶液（1%）和4 mL乙腈提取三聚氰胺，充分搖勻后超聲提取30 min，取出振搖提取10 min，以10 000 r/min離心10 min；上清液轉移至25 mL容量瓶中；殘渣中加入6 mL三氯乙酸溶液（1%）和2 mL乙腈，按上述步驟提取1次，其余步驟同國標GB/T 22388—2008高效液相色譜法[14-15]。

2.4.3 過濾和定容的優化

GB/T 22388—2008高效液相色譜法中，樣品經15 mL三氯乙酸（1%）和5 mL乙腈提振蕩、超聲提取之后，經用三氯乙酸（1%）潤濕的濾紙過濾，轉移至25 mL容量瓶中定容。過濾過程中，三聚氰胺在濾紙上有殘留，導致定容溶液中的三聚氰胺濃度偏低，從而使檢測結果偏低。方法優化為將提取液轉移至25 mL容量瓶中用三氯乙酸（1%）定容，棄去初濾液，從收集的濾液中移取5 mL用作待凈化液。

由表4可知，優化后的液相色譜法測定乳粉質控樣及加標回收試驗的回收率分別為99.0%和98.3%，回收率均接近100%，說明按改進后的液相色譜法，能完全提取乳粉中的三聚氰胺，且在后續過程中有效降低損失，能滿足實際檢測工作的需要。

表4 優化后液相色譜法測定三聚氰胺的結果

2.5 液相色譜-質譜/質譜法的改進

由于液相色譜-質譜/質譜存在基質效應，雖然國標中采取基質配標準的方法降低基質效應，但不能徹底消除基質效應。所以，采用內標法測定乳粉中三聚氰胺[16-17]。稱取1 g乳粉，加入20 ng內標物質，其余步驟按照1.3種液質法進行前處理，所得溶液分別按1.5的條件測定，內標法標準曲線定量計算，最終三聚氰胺的檢測結果見表5。

表5 內標法測定三聚氰胺的結果

結果表明，內標法測定乳粉質控樣及加標回收試驗的回收率分別為100.5%和100.7%，回收率均接近100%，能徹底消除樣品中的基質效應，回收率較國標方法大幅提高，使檢測結果更為準確。

3 結論

通過加標回收試驗探討和改進液相色譜法、液相色譜質譜/質譜法測定乳粉中三聚氰胺的含量。通過液相色譜柱的選用、超聲時間和提取次數的優化、過濾和定容的優化等步驟，優化液相色譜法檢測三聚氰胺的準確度。由于存在較為嚴重的基質效應，使用內標法測量乳粉中的三聚氰胺，大幅提升檢測的準確度。通過回收率試驗，優化乳粉中三聚氰胺檢測的2種方法，大幅提高檢測數據的準確性。