青楷槭莖皮乙醇提取工藝優化和抗氧化性研究

熊思瑞，金鐵巖

延邊大學農學院（延吉 133002）

青楷槭（Acer tegmeutosumMaxim）屬槭樹科、落葉喬木，普遍高度在10~15 m之間，樹皮顏色偏灰，摸上去略微平滑，有少許黑色裂紋[1]。青楷槭又名青楷子或遼東槭，主要產于中國長白山和俄羅斯遠東地區，是長白山地區特有植物，且資源豐富[2]。目前，已從青楷槭中分離多種生物活性成分，如多酚、紅景天、木質素等。朝鮮、日本等地民間藥方中將青楷槭視為可以防治眼部疾患和肝病的秘方良藥[3]。在國內，人們通過泡水或食用青楷槭莖皮和幼葉來保肝、解酒、抗菌消炎、化毒等。而且，青楷槭還有抗血管增生、抗腫瘤和阻止脂肪生成等藥理作用[4]。

常用的植物生物活性物質提取方法包括傳統水蒸氣蒸餾提取法和有機溶劑提取法[5]。水蒸氣蒸餾法[6]提取植物生物活性物質雜質較多，如無機鹽、蛋白質、糖等，且當水浴溫度過高時破壞生物活性成分的程度還有待進一步研究。有機溶劑提取法[7]操作簡單，生物活性物質的損失減少，提取率高、溶劑用量少，省時省力，不足之處是容易造成溶劑的殘留。青楷槭主要化學成分為多酚類物質，乙醇可以很好地溶解多酚類物質。為避免溶劑殘留的現象，試驗在樣品旋轉蒸發后進行真空冷凍干燥處理。

植物多酚又稱植物單寧，其具有比較強的抗菌活性和抗氧化能力，具有減輕細胞和組織中存在的氧化損傷的作用，因而可以將其作為一種天然的抗氧化劑應用到不同的領域中[8]。DPPH·是一個穩定的以氮原子為中心的質子供體自由基，其在波長為517 nm處具有最大吸收，在其與抗氧化劑反應時，抗氧化劑中的電子與其孤正電子配對，使其在乙醇溶液褪去紫色變為黃色，抗氧化劑的活力強弱[9-10]表現為其褪色程度。2, 2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽與過二硫酸鉀反應，生成綠色的ABTS+·[11]，ABTS+·消除能力是反映抗氧化劑抗氧化能力的關鍵指標。

為進一步分離青楷槭莖皮生物活性成分，豐富槭樹科的利用價值，現探究其醇提物最優提取條件并測定其抗氧化性，為合理利用青楷槭資源提供理論支持。試驗以過孔徑0.250 mm篩的青楷槭莖皮為原料，經乙醇浸泡、旋轉蒸發的方式提取酚類物質，福林-酚法計算總酚含量，利用正交試驗對青楷槭莖皮乙醇提取條件進行優化，在單因素試驗基礎上，選擇料液比、乙醇體積分數及浸泡時間為自變量，以青楷槭莖皮醇提物總酚含量為因變量，采用三因素三水平分析法優化青楷槭莖皮提取條件，并通過測定最優條件提取物的DPPH·、ABTS+·兩種自由基的清除率來評價青楷槭莖皮醇提物的抗氧化作用。BHA擁有較高的抗氧化能力，是一種優秀的抗氧化劑。通過將青楷槭莖皮醇提物的各項測定數據與BHA的各項數據進行比較，則可以較為直觀地體現出其醇提物的抗氧化能力。文章旨在增加青楷槭的綜合利用，為青楷槭莖皮深加工技術的發展提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青楷槭莖皮（延吉市西市場）；福林試劑（上海源葉生物科技有限公司）；DPPH、ABTS、BHA（上海源葉生物科技有限公司）；無水乙醇、沒食子酸、碳酸鈉、過硫酸鉀（天津市科密歐化學試劑有限公司）；無水乙醇、過硫酸鉀、碳酸鈉均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

ME204E型分析天平（梅特勒-托利多）；LT2002TS型電子天平（常熟市天量儀器有限責任公司）；DK-8D型電熱恒溫水浴鍋（無錫沃信儀器有限公司）；SY2000型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（III）型真空抽濾機（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；FD-IC-50型真空冷凍干燥（北京博醫試驗儀器有限公司）；UV-1800型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；1400032S型電熱鼓風干燥箱（上海恒科儀器有限公司）。

1.1.3 溶液的配制

DPPH溶液的配制：參考胡瀟文[12]的方法，準確稱取0.025 6 g DPPH粉末，用無水乙醇充分溶解后轉移入100 mL棕色容量瓶，定容后成功制得濃度為6.49×10-4mol/L的DPPH儲備液，低溫貯藏。使用時用無水乙醇稀釋10倍。

ABTS儲備液：參考李亞會等[13]的方法，將2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液與7.4 mmol/LABTS溶液等體積混合，避光冷藏24 h后使用，現用現稀釋，稀釋液吸光度為0.70±0.020。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

青楷槭莖皮→粉碎→過篩→乙醇浸提→抽濾→旋蒸→真空冷凍干燥→單因素試驗→測定總酚含量→正交試驗→優化青楷槭莖皮醇提條件→抗氧化測定

1.2.2 青楷槭莖皮乙醇提取物的制備

將青楷槭莖皮粉碎，過孔徑0.250 mm篩，取50 g青楷槭莖皮粉末按不同料液比、乙醇體積分數、浸泡時間進行提取，將浸泡后的樣品經過濾后60 ℃旋轉蒸發得到濃縮液。再將濃縮液倒入培養皿中，用保鮮膜密封好以免受到污染，并放入-80 ℃冰箱冷凍24 h后進行冷凍干燥，最終得到青楷槭莖皮乙醇提取物。

1.2.3 沒食子酸標準溶液的繪制

采用Folin-Ciocalteu法[14]進行測定，以沒食子酸作為標準品進行定量。

標準曲線：準確稱取0.110±0.001 g一水合沒食子酸，用無水乙醇溶解到100 mL容量瓶中，分別吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL上述標準溶液到100 mL的容量瓶中，分別得到質量濃度為0，10，20，30，40和50 μg/mL的標準儲備液。

分別移取1.0 mL沒食子酸工作液于10 mL比色管中，分別加5 mL水、1 mL福林酚試劑、3 mL 7.5% Na2CO3溶液，搖勻后避光顯色2 h。在765 nm波長下測定其吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 青楷槭莖皮乙醇提取物總酚含量的測定

取1 mL樣品稀釋液，加入5 mL的蒸餾水，加入1 mL福林試劑和3 mL 7.5%的Na2CO3溶液，避光顯色2 h。在765 nm波長下測定其吸光度，利用曲線計算其含量。總酚含量（μg/mg）按式（1）計算。

式中：ρ為多酚的質量濃度，μg/mL；V為溶液總體積，mL；N為稀釋倍數；m為醇提物質量，mg。

1.2.5 單因素試驗

以總酚浸提含量作為主要測量指標，以乙醇體積分數、料液比、浸泡時間三個因素為影響因素進行單因素試驗。

1.2.5.1 乙醇體積分數對青楷槭莖皮醇提物總酚含量影響

準確稱取50 g青楷槭莖皮粉末，在料液比1∶10（g/mL）、不同體積分數乙醇溶液（60%，65%，70%，75%和80%）、浸泡時間24 h的條件下進行提取，研究不同乙醇體積分數對青楷槭莖皮總酚浸提量的影響。

1.2.5.2 料液比對青楷槭莖皮醇提物總酚含量影響

準確稱取50 g青楷槭莖皮粉末，在乙醇體積分數70%、浸泡時間24 h、不同料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，和1∶25 g/mL）的反應條件下對其進行提取，研究不同料液比對青楷槭莖皮總酚浸提量的影響。

1.2.5.3 浸泡時間對青楷槭莖皮醇提物總酚含量影響

準確稱取50 g青楷槭莖皮粉末，在乙醇體積分數70%、料液比1∶10（g/mL）、不同浸泡時間（6，12，18和24 h）的反應條件下對其進行提取，研究不同浸泡時間對青楷槭莖皮總酚浸提量的影響。

1.2.6 正交試驗

以乙醇體積分數、料液比、浸泡時間為因素，總酚浸提含量為指標，選擇三因素三水平正交試驗，對其中的工藝參數進行優化和設計。

表1 因素及水平表

1.2.7 抗氧化試驗

依據正交試驗得出的結果，對其設計體外抗氧化試驗來測定青楷槭莖皮醇提物的抗氧化性。

1.2.7.1 青楷槭莖皮乙醇提物對DPPH·的清除能力

準確吸取0.1 mL不同質量濃度5，10，50和100 μg/mL的樣品溶液于比色皿中，再加入2.9 mL DPPH標準溶液，充分搖勻，避光條件下靜置30 min，用紫外分光光度計測定其在517 nm處的吸光度。樣品+乙醇組用無水乙醇代替樣品溶液，DPPH+乙醇組用無水乙醇代替DPPH，對照組用BHA溶液代替樣品溶液，以上三組其他操作不變，分別測定吸光度。DPPH·清除率按式（2）計算。

式中：Ai為樣品+DPPH溶液的吸光度；Aj為樣品+無水乙醇的吸光度；Ac為DPPH+無水乙醇的吸光度。

1.2.7.2 青楷槭莖皮乙醇提物對ABTS+·的清除能力

取0.4 mL樣品醇提液，加入3.6 mL ABTS儲備液，避光放置10 min，在734 nm處測定吸光度。對照樣品用無水乙醇代替ABTS溶液，空白樣品用無水乙醇代替樣品醇提液。ABTS+·清除率按式（3）計算。

式中：A0為空白組測得的吸光度；A1為試驗組測得的吸光度。

1.3 數據處理

試驗數據以“平均值±標準方差”統計于Excel中，采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 沒食子酸標準曲線

橫坐標為沒食子酸濃度，縱坐標為765 nm處的吸光度，繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程：y= 0.012 8x+0.011 3，R2=0.998 2。

圖1 沒食子酸標準曲線

2.1.2 乙醇體積分數對青楷槭莖皮醇提物總酚含量影響

由圖2可知，青楷槭莖皮醇提物總酚含量隨乙醇體積分數的增大呈現先上升后下降最終趨于平穩的趨勢。當乙醇體積分數為60%~70%時提取物總酚含量逐步增加，70%時總酚含量達到最大值410.7 μg/mg，顯著高于其他乙醇體積分數（P＜0.05）。在乙醇體積分數70%~75%時，總酚含量有所下降。體積分數為75%~80%時，總酚含量無顯著性差異（P＞0.05）。一方面可能是由于溶液的介質常數隨著乙醇體積分數的不斷增加而減少，傳質所需的能量減少，溶質分子更易進入溶劑，且提高了溶液極性和多酚化合物極性相似率，多酚化合物的水溶解性提高。另外，由于植物細胞遇水迅速膨脹，也增加了材料和溶液的接觸面積，容易被水破壞。同時，由于多酚的活性官能團中羥基較易和水結合形成氫鍵作用，而其他基團則既可溶于水中也能被酒精萃取。所以，適當比例水的存在也有助于提高目標物質提取效率[15-17]。綜上所述，選擇乙醇體積分數60%，70%和80%作為正交試驗中乙醇體積分數的因素水平。

圖2 乙醇體積分數對青楷槭莖皮醇提物總酚含量的影響

2.1.3 料液比對青楷槭莖皮醇提物總酚含量影響

由圖3可知，青楷槭莖皮醇提物總酚含量隨液體占比的增大先升高后下降。在料液比為1∶5~1∶10（g/mL）時醇提物總酚含量逐漸增加，并在料液比為1∶10（g/mL）時達到最大值，總酚含量為410.7 μg/mg顯著高于其他料液比（P＜0.05）。隨著液體占比的繼續增加，總酚的提取量逐漸下降。溶劑量的增加增大了料液接觸面積、溶液傳質推動力以及濃度梯度，利于酚類物質溶出；但當溶劑量過大，物料吸附溶劑的量也隨之變大，從而導致酚類物質被物料吸附而不易溶出，不僅造成了浪費且增大了后續回收難度[18]。綜上所述，料液比在1∶10（g/mL）時，青楷槭莖皮醇提物總酚含量最高，從節省溶劑消耗，降低提取成本角度考慮，選擇1∶5，1∶10和1∶15（g/mL）的料液比作為正交試驗中料液比的因素水平。

圖3 料液比對青楷槭莖皮醇提物總酚含量的影響

2.1.4 浸泡時間對青楷槭莖皮醇提物總酚含量影響

由圖4可知，青楷槭莖皮醇提物總酚含量隨著浸泡時間的延長呈現先升高后下降的趨勢，浸泡時間為12 h時總酚提取含量為415.4 μg/mg，顯著高于其他浸泡時間（P＜0.05）。開始時隨著浸泡時間變長，青楷槭莖皮總酚物質不斷被溶出，當達到一定時間后，青楷槭莖皮中總酚物質被基本溶出，即使再增加提取時間也不能達到明顯的提取效果。隨著時間的繼續進行，有些酚類物質可能出現降解、縮合、氧化等反應，導致總酚得率的下降[19]。因此綜合考慮，選擇6，12和18 h的浸泡時間作為正交試驗中浸泡時間的因素水平。

圖4 浸泡時間對青楷槭莖皮醇提物總酚含量的影響

2.2 正交試驗優化青楷槭莖皮醇提總酚含量結果

2.2.1 正交試驗方法與結果

根據單因素試驗結果，以料液比、乙醇體積分數、浸泡時間為主要的影響因素，每個因素分別考察3個水平，選用1.2.6小節因素及水平表安排試驗。

采用正交試驗對青楷槭莖皮乙醇浸提總酚含量的條件及相關主要因素進行綜合優化，以紫外分光光度計測定的吸光度計算總酚含量，考察乙醇體積分數、料液比、浸泡時間的綜合正交影響，設計了三因素三水平正交試驗，試驗研究結果及方差分析可參考表2和表3。

表2 正交試驗及結果

表3 方差分析

由表2可知，根據直觀分析法中極差的大小，對因素進行主次排序，次序為B＞A＞C，即乙醇體積分數＞料液比＞浸泡時間，最優組合為A2B1C1，即料液比1∶10（g/mL）、乙醇體積分數60%、浸泡時間6 h。

2.2.2 驗證試驗結果

按試驗組（A2B1C1）組合的乙醇提取條件與對照組（A2B2C3）進行驗證試驗。

由表4可知，在料液比1∶10（g/mL）、乙醇體積分數60%、浸泡時間6 h條件下，試驗組比對照組總酚含量提高了15.80%。

表4 驗證試驗結果

2.3 抗氧化試驗結果

2.3.1 青楷槭莖皮乙醇提物對DPPH·的清除效果

由圖5可知，在測定濃度范圍內，陽性對照BHA和青楷槭莖皮乙醇提取物均隨樣品濃度增加而增加。當質量濃度為500 μg/mL時，青楷槭莖皮醇提物對DPPH·清除率為89.26%，顯著高于BHA對DPPH·清除率60.01%（P＜0.05），與薄采穎等[20]提取的松樹皮多酚清除DPPH·自由基活性趨勢一致。因此青楷槭莖皮乙醇提取物的DPPH· 清除率與提取物濃度之間存在良好的量效關系且高濃度條件下抗氧化能力較強[21]。

圖5 青楷槭莖皮乙醇提取物與BHA清除DPPH·能力對比

2.3.2 青楷槭莖皮乙醇提物對ABTS+·的清除效果

由圖6可知，在測定濃度范圍內，青楷槭莖皮乙醇提取物對ABTS+·的清除率與BHA接近均隨濃度增大而增強。當質量濃度超過50 μg/mL時，BHA對ABTS+·的清除率達到93.19%，高于青楷槭莖皮乙醇提取物對ABTS+·的清除率（最高清除率為92.28%）但并無顯著性差異（P＞0.05），與戴妙妙[22]研究的紫娟茶中花青素提取物對ABTS+·陽離子自由基的能力趨勢一致。說明青楷槭莖皮乙醇提取物有著較強的ABTS+·清除能力，且在較高濃度下的抗氧化能力更為可觀。

圖6 青楷槭莖皮乙醇提取物與BHA清除ABTS+·能力對比

3 結論

試驗采用單因素試驗和正交試驗兩種方法優化得到最佳工藝：料液比1∶10（g/mL）、乙醇體積分數60%、浸泡時間6 h，此時總酚含量為577.8 μg/mg。最優提取條件下的青楷槭莖皮醇提物具有良好的抗氧化能力和對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力。試驗為進一步分離青楷槭莖皮生物活性成分、豐富槭樹科的利用價值、開發利用青楷槭資源提供理論依據。