山楂葉多糖提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化和抑菌活性研究

李杰，田思雨，譚怡然，趙嘉，周銘懿

1. 錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121001）；2. 遼寧省肉類加工與質(zhì)量安全控制專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心 錦州醫(yī)科大學(xué)（錦州 121001）

山楂葉為薔薇科植物山楂（Crataegus pinnatifidaBge.）的干燥葉，主產(chǎn)于我國華北、東北等地。山楂葉中富含各種生物活性物質(zhì)，包括黃酮類、氨基酸、多糖、維生素、微量元素[1]。植物多糖的來源廣泛、高效且無毒副作用[2]。由于植物多糖被證實具有諸多生理功能，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂等作用[3]，使得對其研究日益受到關(guān)注。目前對山楂葉中活性物質(zhì)研究主要集中在黃酮類化合物提取、功能特性等方面，對多糖類物質(zhì)的研究較少。

目前對多糖的提取多采用熱水提取、超聲輔助提取[4]、酶輔助提取及微波輔助提取[5-6]等方法。采用傳統(tǒng)熱水提取法對山楂葉多糖進(jìn)行提取。采用單因素試驗對山楂葉多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，對提取次數(shù)、料液比、提取時間和提取溫度進(jìn)行了考察，利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化分析。同時通過測定DPPH·自由基和ABTS+自由基的清除率，探討山楂葉多糖的抗氧化能力。此外，還對山楂葉多糖的抑菌活性進(jìn)行研究，以期為山楂葉作為天然抗氧化功能產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山楂葉（廣西桂林天堂漓江有限公司）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（江西佰草源生物科技有限公司）；石油醚、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、抗壞血酸（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；DPPH·試劑、ABTS+試劑（上海研啟生物科技有限公司）；所有試劑均為分析純。

RE-2 000 B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DF-101 S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（韓國DAIHAN公司）；UV-1600紫外可見分光光計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；LC-20 a高效液相色譜儀（島津儀器蘇州有限公司）；SHZ-DⅢ予華牌循環(huán)水真空泵（陜西太康生物科技有限公司）；MIKRO220 R高速低溫離心機(jī)（德安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 山楂葉多糖提取

1.2.1.1 山楂葉的預(yù)處理

將鮮山楂葉在60 ℃干燥24 h，烘干后用粉碎機(jī)粉碎，然后將粉碎的山楂葉粉末過0.250 mm篩，并將過篩后的山楂葉粉末收集備用。稱取100 g處理好的山楂葉粉與2 L石油醚混合，室溫攪拌處理12 h，并重復(fù)3次。抽濾，將石油醚除去，即得除脂的山楂葉粉末，收集備用。

1.2.1.2 提取工藝

參考龔頻等[7]的方法稍作修改。準(zhǔn)確稱取4 g脫脂后的山楂葉粉，在一定的料液比、提取次數(shù)、提取時間和提取溫度下提取粗多糖。然后離心（6 000 r/min，10 min）收集上清液，負(fù)壓濃縮后，向提取液中加入4倍體積的無水乙醇，在4 ℃過夜沉淀，離心后收集沉淀，并冷凍干燥即為山楂葉粗多糖。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考Lin等[8]的苯酚-硫酸法。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取10 mg葡萄糖加蒸餾水，定容至10 mL容量瓶中，配制成 1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。準(zhǔn)確吸取0，0.1，0.3，0.5，0.7和0.9 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)對照溶液，分別定容至10 mL容量瓶中。取各稀釋液1 mL于試管中，依次添加1 mL 5%的苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液、5 mL濃硫酸，充分混合后靜置30 min冷卻至室溫后，用蒸餾水作為空白對照，在490 nm波長處測吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.003 87x+0.006 75，R2=0.998。

1.2.1.4 多糖含量的測定

用1.1.2.3小節(jié)中的方法測定吸光度。并計算山楂葉粗多糖的得率，山楂葉多糖得率按式（1）計算。

式中：C為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為樣品溶液體積，mL，M為山楂葉粉質(zhì)量，mg。

1.2.2 多糖提取工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素試驗

以粗多糖得率為指標(biāo)，分析料液比、提取次數(shù)、提取時間和提取溫度四個因素對粗多糖得率的影響。固定各因素水平：料液比1∶40 g/mL，提取次數(shù)2次，提取時間2 h，提取溫度80 ℃。改變各因素水平參數(shù)：提取次數(shù)為1，2，3，4和5次時，分析提取次數(shù)對得率的影響；料液比為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60 g/mL時，分析料液比對得率的影響；提取時間為1，1.5，2，2.5和3 h時，分析提取時間對得率的影響；提取溫度為60，70，80，90和100 ℃時，分析提取溫度對得率的影響。根據(jù)單因素結(jié)果進(jìn)行正交試驗，從而確定粗多糖的最佳提取工藝參數(shù)。

1.2.2.2 響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，對提取料液比、提取時間和提取溫度3個因素分別取3個水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗，優(yōu)化山楂葉多糖提取工藝。響應(yīng)面試驗的三因素三水平選取見表1。

水平 因素A料液比/(g·mL-1) B提取時間/h C提取溫度/℃-1 1∶30 1.5 80 0 1∶40 2.0 90 1 1∶50 2.5 100

1.2.3 體外抗氧化性測定

1.2.3.1 DPPH·自由基清除能力的測定

參考張婉君等[9]測定方式并進(jìn)行修改。分別取不同質(zhì)量濃度梯度（0.5，1，2，3，4和5 mg/mL）的多糖溶液與抗壞血酸于不同試管中，加入2.0 mL DPPH· 溶液，再加0.5 mL蒸餾水搖勻室溫避光靜置30 min，在波長517 nm下分別測定吸光度。按式（2）計算DPPH·的清除率。

式中：A0為空白溶液吸光度；A1為多糖或抗壞血酸溶液吸光度；A2為樣品溶液本底吸光度。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力的測定

參考韋志等[10]的方法。取與1.2.3.1小節(jié)相同濃度梯度的多糖溶液進(jìn)行試驗，以抗壞血酸VC為陽性對照，體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇與ABTS+工作液混合液為參比液，在波長734 nm處測定吸光度，進(jìn)而計算粗多糖對ABTS+自由基的清除率，按式（3）計算。

式中：A0為空白溶液吸光度；A1為多糖或抗壞血酸溶液吸光度；A2為樣品溶液本底吸光度。

1.3 山楂葉多糖提取液對細(xì)菌生長的影響

用打孔器將濾紙打成直徑9 mm的圓濾紙片，與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基一同在121 ℃條件下滅菌20 min。制作培養(yǎng)基平皿，用無菌移液槍吸取菌懸液，涂布均勻。將滅菌后的濾紙片浸入山楂葉多糖的提取液中30 min，用無菌鑷子取出，晾干，平鋪于含有涂布細(xì)菌的凝固培養(yǎng)基中，倒置放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察測量抑菌圈的直徑。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用響應(yīng)面分析，Design Expert 13及Origin 2019軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、方差分析及試驗數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取次數(shù)對山楂葉多糖得率的影響

由圖1的結(jié)果可知，提取次數(shù)從1次到2次的過程中多糖得率有所增加，提取2次之后多糖得率變化并不明顯。原因可能是提取2次能夠使得全部多糖溶出。所以固定提取次數(shù)2次。

2.1.2 料液比對山楂葉多糖得率的影響

由圖2可知，隨著液料占比不斷增大，山楂葉多糖的得率先升高后降低。料液比為1∶40 g/mL時，山楂葉多糖的得率最高，為8.33%。所以，最佳料液比為1∶40 g/mL。

2.1.3 提取時間對山楂葉多糖得率的影響

由圖3可知，隨著提取時間的延長，山楂葉多糖的得率呈現(xiàn)先升高而后降低的趨勢。當(dāng)提取時間達(dá)到2 h時，多糖得率達(dá)到最大值，為8.63%。可能的原因是隨著提取時間的延長，其他物質(zhì)溶出，導(dǎo)致多糖得率有所下降。因此，最佳提取時間為2 h。

2.1.4 提取溫度對山楂葉多糖得率的影響

由圖4可看出，溫度在60~90 ℃區(qū)間內(nèi)，得率一直呈上升趨勢，且趨勢顯著。在90~100 ℃區(qū)間，得率上升趨勢趨于平穩(wěn)，當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時提取率達(dá)到最大值7.44%。因此選取100 ℃為最佳的提取溫度。

圖4 提取溫度對山楂葉多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果選取料液比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）進(jìn)行響應(yīng)面試驗。響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

通過Design-Expert 13軟件分析試驗數(shù)據(jù)，得二次多項回歸方程：得率Y=8.66+0.423 8A+0.453 8B+ 0.412 5C+0.04AB+0.007 5AC+0.002 5BC-0.704 5A2-0.599 5B2-0.677C2。模型顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

方差分析結(jié)果見表3。模型決定系數(shù)R2為0.997 6，模型顯著性較高，Radj2=0.994 4，能夠解釋試驗響應(yīng)值變異的97.64%，接近預(yù)測相關(guān)系數(shù)PredR2，表明試驗?zāi)Ｐ团c實際數(shù)據(jù)擬合較好。

2.2.2 各因素的交互作用分析

圖5~圖7為各個因素之間兩兩交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖。圖5為料液比和提取時間的交互作用對多糖得率的影響。料液比在1∶30~1∶50 g/mL范圍內(nèi)，提取時間在1.5~2.5 h范圍內(nèi)時，多糖得率的變化趨勢為先增加后降低，二者交互作用使得多糖得率達(dá)到最大值8.69%±0.001 2%。

圖5 料液比和提取時間的交互作用對多糖得率的影響

圖6為料液比和提取溫度的交互作用對多糖得率的影響。料液比在1∶30~1∶50 g/mL范圍內(nèi)，提取溫度在80~100 ℃范圍內(nèi)，隨著料液比和提取溫度的持續(xù)增加，多糖得率先增加后降低，二者交互作用使得多糖得率達(dá)到最大值8.73%±1.46%。

圖7為提取時間和提取溫度的交互作用對多糖得率的影響。提取時間在1.5~2.5 h范圍內(nèi)，提取溫度在80~100 ℃范圍，隨著提取溫度和提取時間的升高，多糖得率均先增加后降低，兩者交互作用使得多糖得率最大值達(dá)到8.68%±0.002%。

圖7 提取時間和提取溫度的交互作用對多糖得率的影響

根據(jù)Design-Expert 13軟件運行結(jié)果，在料液比、提取時間、提取溫度的共同影響下，最優(yōu)提取工藝為料液比1∶43.136 g/mL、提取時間2.195 h、提取溫度93.072 ℃，該條件下模型預(yù)測的得率達(dá)到8.882%。

2.2.3 最優(yōu)工藝條件試驗驗證

結(jié)合實際操作的可行性，在提取次數(shù)2次、料液比1∶43 g/mL、提取時間2.2 h、提取溫度93 ℃條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗，平均提取率為8.916%±0.005%，與模型預(yù)測結(jié)果較吻合，表明響應(yīng)面模型用于分析優(yōu)化得率的最佳工藝有效可行。

2.3 山楂葉多糖的體外抗氧化活性

山楂葉多糖的體外抗氧化活性結(jié)果如圖8所示。ABTS+和DPPH·自由基清除率在0~5.0 mg/mL范圍內(nèi)，都是隨著多糖濃度的升高，其自由基清除率逐漸升高。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到5.0 mg/mL時，ABTS+自由基的清除率為46.24%±0.26%，與VC相比相差較大。而DPPH·自由基的清除率可達(dá)到70.18%±0.04%。結(jié)果表明山楂葉多糖具有良好的抗氧化活性。

圖8 DPPH·自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力

2.4 山楂葉多糖的抑菌效果

對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌3種細(xì)菌進(jìn)行抑菌試驗，由表4可看出，在圓濾紙片的周圍均出現(xiàn)抑菌圈，說明山楂葉多糖提取液對這3種細(xì)菌的生長都有抑制作用。從抑菌圈直徑大小可以看出，山楂葉多糖對大腸桿菌的抑制作用最明顯。

表4 山楂葉多糖對細(xì)菌的抑制試驗

3 結(jié)論

此試驗研究了山楂葉多糖的提取工藝條件及其抗氧化活性和抑菌活性。通過單因素試驗及響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果可得出：提取山楂葉多糖的最優(yōu)工藝條件為提取次數(shù)2次、料液比1∶43 g/mL、提取時間2.2 h、提取溫度93 ℃，此時山楂葉多糖的平均提取率為8.916%±0.005%，與響應(yīng)面模型預(yù)測值相符。

山楂葉多糖對DPPH·和ABTS+都有清除能力，ABTS+自由基的清除率為46.24%±0.26%，DPPH·自由基的清除率可達(dá)到70.18%±0.04%。抑菌試驗研究結(jié)果表明，在最優(yōu)的提取工藝條件下，山楂葉多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌都起到抑制作用，但抑制的程度并不相同。