GSTP1通過調節JNK通路抑制癲癇大鼠海馬區星形膠質細胞炎性激活

趙增霞, 劉 波, 劉淑云, 黃正義

癲癇是由大腦神經元的異常、高度同步放電引起的一類難治的神經系統疾病[1,2]。癲癇的發病機制十分復雜,涉及一系列神經信號與突觸結構的改變、細胞凋亡以及炎癥過度激活等[3]。目前尚無治療癲癇的特異性藥物,并且約一半的患者因耐藥導致療效不佳[4]。近年來一些證據表明,星形膠質細胞在癲癇發生過程中扮演相當重要的角色,而通過特定機制調節星形細胞炎性激活可以改善癲癇發生[5]。谷胱甘肽硫轉移酶P1(GSTP1)是體內廣譜的生物轉化解毒酶,具有保護細胞并防止DNA損傷的作用。既往研究報道,GSTP1在癲癇患者腦內星形膠質細胞中表達并定位于細胞質[6]。

本研究旨在明確GSTP1對星形膠質細胞炎性激活的影響及相關分子機制,以期為癲癇治療提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 脂多糖與茴香霉素(JNK激活劑)來自上海碧云天生物技術公司,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)相關試劑盒來自上海科艾博生物公司,GSTP1過表達載體與對照載體來自上海吉瑪基因公司,GSTP1、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化(p)-JNK抗體來自美國CST公司。

1.2 大鼠飼養 16只10周齡SPF 級雄性SD大鼠(體質量250～300 g)來自廣東醫科大學實驗動物中心。飼養溫度：(22±2)℃,濕度：40%～60%,光照周期：12 h/12 h,適量的水與飼料。動物實驗方案已得到深圳市龍華區中心醫院醫學倫理委員會審批。

1.3 建立癲癇模型 大鼠被隨機分為正常組與癲癇組(n=8)。癲癇組腹腔注射氯化鋰(125 mg/kg),18～20 h后腹腔注射匹魯卡品(20 mg/kg)。隨后每30 min腹腔注射匹魯卡品(10 mg/kg)一次,直至觀察到癲癇持續狀態。觀察大鼠的行為并根據Racine標準進行評分[7],其中4～5分即為成功建模。正常組腹腔注射相同體積的0.9%生理鹽水,其他操作與癲癇組相同。28 d后所有大鼠用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后行安樂死處理,收集海馬區腦組織。

1.4 細胞培養與脂多糖處理 大鼠原代星形膠質細胞采用RPMI-1640培養基與10% FBS培養,并添加2 mmol/L谷氨酰胺、100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素。細胞培養條件設為37 ℃、95%空氣、5% CO2。采用不同濃度脂多糖(0 μg/ml、0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml)誘導處理48 h。

1.5 細胞轉染 取100 μg/ml脂多糖誘導原代星形膠質細均鋪在6孔板,利用Advanced高效DNA/RNA轉染試劑分別向細胞中轉染4.0 μg GSTP1過表達載體與4.0 μg對照載體,48 h后收集細胞。

1.6 蛋白質印跡 提取組織與細胞中的總蛋白,取45 μg總蛋白進行電泳,并常規轉膜。5%脫脂奶粉常溫封閉2 h,之后4 ℃孵育抗體過夜,濃度如下：GSTP1(1∶1000稀釋)、JNK(1∶1000稀釋)、p-JNK(1∶2000稀釋)。隨后將膜與合適二抗37 ℃孵育1 h,通過超敏化學發光液檢測陽性條帶,并分析目的蛋白的表達情況。

1.7 ELISA 通過ELISA裂解液提取上清蛋白,取各組蛋白樣本加入反應板并常溫孵育1 h。隨后依次加入生物素化抗體、酶結合物工作液以及顯色底物。通過多功能酶標儀分析各組在450 nm波長下的吸光度值,計算腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6濃度。

1.8 谷氨酸(Glu)濃度測定 取適量組織與細胞,離心4 min后取上清,采用高效液相色譜測定Glu濃度。

1.9 拯救試驗 取GSTP1過表達載體轉染成功的原代星形膠質細均鋪在6孔板。之后向細胞中添加10 μmol/L茴香霉素處理24 h。收集細胞,檢測GSTP1、JNK、p-JNK蛋白表達水平以及TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu濃度。

2 結 果

2.1 癲癇大鼠海馬區腦組織中炎癥因子與Glu濃度以及GSTP1、JNK、p-JNK蛋白表達水平 與正常大鼠組比較,癲癇大鼠組中TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu濃度升高,GSTP1蛋白表達水平降低,p-JNK蛋白表達水平升高,差異有顯著性(P均<0.05)。上述兩組中JNK蛋白表達水平比較,差異無顯著性(P>0.05)。GSTP1與p-JNK蛋白表達水平呈負相關(r=-0.63,P<0.05) (見圖1)。

2.2 不同濃度脂多糖誘導對星形膠質細胞中炎癥因子與Glu濃度的影響 脂多糖誘導后TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu濃度呈劑量依耐性升高,差異有顯著性(P<0.05),表明脂多糖可以誘導原代星形膠質細胞炎性激活(見圖2)。

2.3 不同濃度脂多糖誘導對星形膠質細胞中GSTP1、JNK、p-JNK蛋白表達水平的影響 脂多糖誘導后GSTP1蛋白表達水平呈劑量依耐性降低,而p-JNK蛋白表達水平呈劑量依耐性升高,差異有顯著性(P均<0.05)。上述各組中JNK蛋白表達水平沒有明顯變化,差異無顯著性(P>0.05)。該結果表明,脂多糖可以誘導JNK通路激活(見圖3)。

2.4 過表達GSTP1對脂多糖誘導星形膠質細胞炎性激活的影響 與對照載體組比較,GSTP1過表達載體組中GSTP1蛋白表達水平升高,p-JNK蛋白表達水平降低,TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu濃度降低,差異有顯著性(P均<0.05)。上述兩組中JNK蛋白表達水平比較,差異無顯著性(P>0.05)。該結果表明,過表達GSTP1抑制脂多糖誘導星形膠質細胞炎性激活與JNK通路激活(見圖4)。

2.5 激活JNK通路對GSTP1在脂多糖誘導星形膠質細胞炎性激活中的作用的影響 與GSTP1過表達載體組比較,茴香霉素+GSTP1過表達載體組中p-JNK蛋白表達水平以及TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu濃度升高,差異有顯著性(P均<0.05)。上述兩組中JNK蛋白表達水平比較,差異無顯著性(P>0.05)。該結果表明,激活JNK通路可以部分逆轉GSTP1對脂多糖誘導星形膠質細胞炎性激活的抑制作用(見圖5)。

A：TNF-α、IL-1β、IL-6濃度升高;B：Glu濃度升高;C：GSTP1、JNK、p-JNK蛋白質印跡圖;D：GSTP1蛋白表達降低;E：JNK蛋白表達無顯著變化;F：p-JNK蛋白表達升高。與正常大鼠組比較*P<0.05

A：TNF-α濃度升高;B：IL-1β濃度升高;C：IL-6濃度升高;D：Glu濃度升高。1～5分別代表：0、0.1、1、10、100 μg/ml。與前一誘導濃度比較*P<0.05

A：GSTP1、JNK、p-JNK蛋白質印跡圖;B：GSTP1表達降低;C：JNK蛋白表達無顯著變化;D：p-JNK表達升高。與前一誘導濃度比較*P<0.05

A：GSTP1蛋白質印跡圖;B：GSTP1蛋白過表達;C：過表達GSTP1降低TNF-α、IL-1β、IL-6濃度;D：過表達GSTP1降低Glu濃度;E：JNK與p-JNK蛋白質印跡圖;F：過表達GSTP1不影響JNK表達;G：過表達GSTP1抑制p-JNK表達。與對照載體組比較*P<0.05

A：JNK與p-JNK蛋白質印跡圖;B：茴香霉素不影響JNK表達;C：茴香霉素促進p-JNK表達;D：茴香霉素提高TNF-α、IL-1β、IL-6濃度;E：茴香霉素提高Glu濃度。與GSTP1過表達載體組比較*P<0.05

3 討 論

越來越多的研究表明,促炎因子通過改變星形膠質細胞與神經元的交流,從而引起癲癇相關的神經元產生損傷,導致癲癇發作[8]。例如,Liyis等[9]報道高遷移率族蛋白1(HMGB1)可以誘導星形膠質細胞炎性激活,引起促炎癥因子如IL-1β和TNF-α大量產生,而HMGB1抗體通過抑制P-糖蛋白表達而改善癲癇。Zhu等[10]報道髓樣分化因子88(MYD88)在癲癇大鼠的星形膠質細胞中具有促炎作用,靶向MYD88可以減弱海馬區神經元的損傷。此外,離子型P2X7受體(P2X7R)是炎癥反應的一個重要驅動因子,靶向P2X7R可以有效對抗癲癇大鼠發作的嚴重程度[11]。然而阻斷上述基因并不能完全治愈癲癇,說明星形膠質細胞炎性激活仍存在其他的調控途徑。本研究發現,GSTP1通過調節JNK通路抑制癲癇大鼠海馬區星形膠質細胞炎性激活,有助于進一步深化炎性激活介導癲癇發生的分子機制。

GTSP1基因位于人第11染色體長臂1區3帶,由7個外顯子組成,編碼的蛋白分子量約為23 kDa。研究表明,GSTP1在維持細胞氧化平衡、調節腫瘤發生和對抗組織損傷方面起著重要作用[12,13]。最近,Wang等[14]發現具有GSTP1 rs1695位點G等位基因的癲癇兒童中由丙戊酸鈉引起的谷草轉氨酶異常的風險降低。與既往報道一致[15],本研究發現癲癇大鼠海馬區腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu濃度均高于正常大鼠,證實癲癇中存在炎性激活。隨后通過蛋白質印跡發現,癲癇大鼠中GSTP1蛋白表達水平低于正常大鼠,與Sato等[16]報道結果相符。此外,在脂多糖誘導星形膠質細胞炎性激活的細胞模型中也檢測到GSTP1蛋白表達水平呈劑量依耐性降低?；谝陨辖Y果,我們推測GSTP1可能參與調控星形膠質細胞炎性激活。

為了明確GSTP1在炎性激活中的作用,我們采用GSTP1過表達載體處理星形膠質細胞。結果發現TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu濃度降低,證實過表達GSTP1抑制脂多糖誘導星形膠質細胞炎性激活。該結果與Bi等[17]報道的GSTP1抑制脂多糖誘導人急性單核白血病細胞的炎癥反應結果一致。最近Zhang等[18]一項研究也證實GSTP1可以抑制脂多糖誘導肝臟炎癥反應。此外,本研究發現癲癇大鼠中p-JNK蛋白表達水平高于正常大鼠,且GSTP1與p-JNK蛋白表達水平呈負相關。同時在脂多糖誘導星形膠質細胞炎性激活的細胞模型中也發現p-JNK蛋白表達水平呈劑量依耐性升高。二者結果提示,GSTP1可能調控JNK通路激活。

JNK通路參與調控多種病理生理過程,包括免疫與炎癥反應、細胞增殖與凋亡、腫瘤形成與發展等[19,20]。JNK通路與癲癇發生密切相關,而p-JNK是JNK通路激活的關鍵效應分子[21,22]。本研究中我們觀察到過表達GSTP1抑制星形膠質細胞中p-JNK表達,表明GSTP1具有抑制JNK通路激活的作用。進一步通過茴香霉素對JNK通路進行激活,發現茴香霉素可以對抗GSTP1的抑制作用,提高星形膠質細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu濃度。該結果充分表明,激活JNK通路可以部分逆轉GSTP1對脂多糖誘導星形膠質細胞炎性激活的抑制作用。

綜上所述,GSTP1蛋白在癲癇大鼠海馬區腦組織中低表達,而p-JNK蛋白高表達。過表達GSTP1抑制脂多糖誘導星形膠質細胞炎性激活,其分子機理與抑制JNK通路激活相關。下一步研究計劃將在臨床樣本中驗證GSTP1的功能。