lncRNA NEAT1沉默通過IL-10/STAT3信號通路調節小膠質細胞極化對腦缺血再灌注損傷大鼠的影響

張亞杰, 尹立勇, 董曉嬌, 劉宏麗

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是指在血液灌流短期恢復后,缺血缺氧引起的神經損傷進一步加重的病理過程。小膠質細胞作為免疫效應細胞,是中樞神經系統的第一道防線[1]。腦缺血可誘導小膠質細胞活化,激發促炎因子的生成,會對正常組織和細胞進行破壞[2]。M1型和M2型是小膠質細胞不同的極化形式,一些研究表明,CIRI的潛在治療手段是將M1轉化為M2[3,4]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)核富集轉錄體1(nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1)在免疫系統中發揮著重要作用,已被證明其表達水平在缺血性腦卒中患者中顯著上調,并與腦卒中嚴重程度呈正相關[5]。而敲低lncRNA NEAT1可調節小膠質細胞的活化并減少腦缺血再灌注后神經元凋亡。因此,lncRNA NEAT1可能是CIRI治療干預的新潛在靶點。然而,lncRNA NEAT1調節小膠質細胞活化的分子機制尚不明確。白細胞介素(interleukin,IL)-10/信號傳導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通路介導的抗炎反應代表了一種控制炎癥程度和持續時間的重要穩態機制[6]。STAT3是IL-10下游的轉錄因子,IL-10與其受體結合后可激活STAT3,其中磷酸化的STAT3可誘導小膠質細胞的極化來發揮抗神經炎癥作用[7]。因此,筆者推測lncRNA NEAT1可能通過IL-10/STAT3通路調節小膠質細胞極化,進而參與CIRI,并對此展開了研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠96只,SPF級,7～8周齡,體重282～312 g,購自青島博隆實驗動物有限公司,許可證號：SCXK(魯)2021-0007。大鼠飼養于溫度21 ℃～24 ℃,濕度52%～60%的環境中,12 h光暗交替,自由飲食進水。本研究經本院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 lncRNA NEAT1小干擾RNA質粒(si-NEAT1)及其陰性對照質粒(si-NC)由吉林萬孚生物技術有限公司設計合成;HE染色試劑盒、氯化三苯基四氮唑(TTC)試劑、尼氏(Nissl)染色液、RIPA裂解液、逆轉錄試劑盒、ECL化學發光試劑盒(批號分別為MA5-2772、MA2-2839、MA4-3095、MA1-2390、MA6-1899、MA7-2904)均購自連云港伊勢久生物科技有限責任公司;Trizol試劑、BCA蛋白檢測試劑盒、PCR試劑盒、白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-4、IL-10酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號分別為T88771、T24909、T40920、T23022、T20950、T50932、T08394)均購自東莞市瀚克生物技術有限公司;鼠源離子鈣接頭蛋白分子1(Iba1)(小膠質細胞標記物)、巨噬細胞M1型極化標志物(CD86)、巨噬細胞M2型極化標志物(CD206)一抗、羊抗鼠二抗、兔源IL-10、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、β-actin一抗、羊抗兔二抗(批號分別為ZK-13818、ZK-03827、ZK-48298、ZK-02783、ZK-18287、ZK-37422、ZK-38203、ZK-17115、ZK-77392)均購自襄陽凱得爾森生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 共聚焦顯微鏡(型號Leica confocal 118 SP5)、光學顯微鏡(型號DMi1)購自安徽正華生物儀器設備有限公司;熒光定量PCR儀(型號eQ162C)、酶標儀(型號PT-3502C)購自天津金思德生物技術有限公司;凝膠成像系統(型號UVCI 2400)購自廈門洛肯儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 CIRI建模及分組給藥 采用線栓法構建CIRI模型[8]：戊巴比妥鈉麻醉大鼠,隨后,以仰臥位固定在手術臺上并剃光毛發以暴露頸部,切開皮膚,分離右頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈,結扎頸外動脈,將線栓經右頸總動脈插入頸內動脈,直到感覺到輕度的阻力,表明右大腦中動脈閉塞了,這會導致右大腦中動脈提供的區域血流暫時停止,2 h后,取出線栓,以使血液通過右頸內動脈回流(實現再灌注),隨后,縫合皮膚,在整個過程中,保持大鼠的體溫在37 ℃左右。造模3 h后,采用Zea-Longa評分法[9]對大鼠進行評分,將Zea-Longa評分>1分的大鼠視為CIRI造模成功。將成功造模的72只大鼠隨機分成：CIRI組、CIRI+si-NC組、CIRI+si-NEAT1組,每組24只。另取24只大鼠麻醉后進行相同的手術程序,但沒有阻斷右側大腦中動脈作為假手術組(Sham組)。建模結束后,CIRI+si-NC組、CIRI+si-NEAT1組大鼠分別給予尾靜脈注射100 μl si-NC或si-NEAT1[10];Sham組和CIRI組大鼠尾靜脈注射相等體積的生理鹽水,每天一次,連續注射7 d。

1.2.2 神經功能缺損評分 末次尾靜脈注射給藥24 h后使用Zea-Longa評分法[9]進行大鼠神經功能缺損評估：0分為無神經缺陷;1分為提尾時左前爪不能完全伸展;2分為動物走路時向對側轉;3分為行走時向對側傾斜;4分為沒有自發運動活動和意識水平低下。分數越高表示神經功能缺損越嚴重。

1.2.3 TTC染色檢測腦梗死體積百分比 神經功能缺損檢測完成后,每組隨機選取8只大鼠,處死后迅速斷頭取腦,-20 ℃環境下迅速冷凍10 min,然后沿冠狀切開腦組織,切2 mm厚片,37 ℃環境下置于1%的TTC溶液中避光孵育30 min(期間翻動腦片一次),4%多聚甲醛固定。正常的大腦區域被染成深紅色,梗死區域被染成白色。拍照,用Image Pro Plus 6.0軟件計算校正水腫后腦梗死體積百分比(%),腦梗死體積百分比(%)=(對側半球面積-同側非梗死區域面積)/對側半球面積×100%。

1.2.4 HE和Nissl染色觀察腦組織病理學變化 每組隨機選取8只大鼠,麻醉后取缺血側腦組織,分為兩部分,一部分用30%的蔗糖脫水、包埋,制備腦組織冰凍切片;另一部分用4%多聚甲醛固定24 h后,將腦組織脫水,石蠟包埋并切成冠狀切片(5 μm)。取腦組織石蠟切片脫蠟、水洗,分別進行HE、Nissl染色,顯微鏡下觀察并評估切片的病理變化。

1.2.5 免疫熒光染色分析小膠質細胞極化 取1.2.4中制備的腦組織冰凍切片,孵育1.5 h,加入鼠源Iba1(1∶750)、CD86(1∶50)或CD206(1∶25),4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次,加入羊抗鼠二抗(1∶1650)后孵育。DAPI復染10 min,使用激光共聚焦顯微鏡觀察大腦皮質Iba1陽性(Iba1+)細胞中CD86和CD206陽性(Iba1+CD86+、Iba1+CD206+)細胞的數量,以Iba1+CD86+代表小膠質細胞M1型極化,以Iba1+CD206+代表小膠質細胞M2型極化,拍照,用Image J軟件進行量化。每個切片隨機選擇6個顯微鏡視野計算平均值。數據表示為每平方毫米的平均細胞數。

1.2.6 ELISA法檢測大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平 取各組剩余8只大鼠,取腦組織缺血側皮質區,分為兩部分,一部分-80 ℃冰箱保存備用;另一部分按1∶9的比例加入適量預冷生理鹽水,置于冰上研磨,4 ℃下3500 r/min離心13 min,取上清。按ELISA試劑盒的操作方法檢測大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平。

1.2.7 熒光定量PCR法檢測大鼠腦組織中lncRNA NEAT1、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg-1)、IL-10 mRNA水平 取1.2.6中大鼠腦組織解凍勻漿,Trizol提取總RNA,逆轉錄合成cDNA,以此為模板,PCR法檢測大鼠腦組織中lncRNA NEAT1、iNOS、Arg-1、IL-10 mRNA水平(β-actin為內參),引物由東莞市瀚克生物技術有限公司設計合成,引物序列(見表1)。具體反應環境、條件均參照PCR試劑盒說明書進行配置,2-△△Ct法分析大鼠腦組織中lncRNA NEAT1、iNOS、Arg-1、IL-10 mRNA水平。

表1 引物序列

1.2.8 蛋白印跡法檢測大鼠腦組織中IL-10、STAT3、p-STAT3蛋白水平 取1.2.6中大鼠腦組織解凍勻漿,裂解,4 ℃下11 200 r/min離心14 min,取上清,BCA法定量總蛋白,電泳分離后轉膜,5%脫脂牛奶封閉2.5 h,加入稀釋好的兔源IL-10(1∶720)、STAT3(1∶800)、p-STAT3(1∶1250)、內參β-actin(1∶900)一抗,4 ℃下孵育過夜,加入羊抗兔二抗(1∶2350),室溫下孵育2.5 h。ECL化學發光試劑盒顯影,Image Pro Plus 6.0軟件分析蛋白質條帶,計算蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分和腦梗死體積百分比比較 與Sham組相比,CIRI組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積百分比顯著升高(P<0.05);與CIRI組相比,CIRI+si-NC組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積百分比差異無統計學意義(P>0.05);與CIRI組和CIRI+si-NC組相比,CIRI+si-NEAT1組神經功能缺損評分、腦梗死體積百分比顯著降低(P<0.05)(見表2、圖1)。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色圖(×40)

表2 各組大鼠神經功能缺損評分和腦梗死體積百分比比較

2.2 各組大鼠腦組織病理學變化 HE染色顯示：Sham組大鼠腦組織神經元正常;與Sham組相比,CIRI組大鼠腦組織神經元水腫、空泡樣變性明顯,組織間隙較大,核染色較深;CIRI+si-NC組大鼠腦組織神經元上述病變與CIR組相似;與CIRI組和CIRI+si-NC組相比,CIRI+si-NEAT1組大鼠腦組織神經元上述病變得到緩解,神經元水腫、空泡樣變性明顯減輕,細胞核較清晰,染色較為均勻。

Nissl染色結果與HE染色相似,Sham組大鼠腦組織神經元排列整齊致密,胞體大而藍染,尼氏體豐富;與Sham組相比,CIRI組大鼠腦組織神經元排列紊亂、核仁消失、空泡樣變,尼氏體數量明顯減少;CIRI+si-NC組大鼠腦組織神經元上述病變與CIR組相似;與CIRI組和CIRI+si-NC組相比,CIRI+si-NEAT1組大鼠腦組織神經元液泡樣變化和核固縮減少,尼氏體數量明顯增多(見圖2)。

圖2 各組大鼠腦組織神經元病理學變化圖(比例尺=100 μm,HE、Nissl染色,×200)

2.3 各組大鼠腦組織中小膠質細胞極化比較 與Sham組相比,CIRI組大鼠腦組織中Iba1+CD86+、Iba1+CD206+陽性細胞數量、CD86/CD206比值均顯著升高(P<0.05);與CIRI組相比,CIRI+si-NC組大鼠腦組織中Iba1+CD86+、Iba1+CD206+陽性細胞數量、CD86/CD206比值差異無統計學意義(P>0.05);與CIRI組和CIRI+si-NC組相比,CIRI+si-NEAT1組大鼠腦組織中Iba1+CD86+陽性細胞數量、CD86/CD206比值均顯著降低(P<0.05),Iba1+CD206+陽性細胞數量顯著升高(P<0.05)(見圖3、表3)。

表3 各組大鼠腦組織中小膠質細胞極化比較

圖3 各組大鼠腦組織免疫熒光染色圖(比例尺=100 μm,×200)

2.4 各組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平比較 與Sham組相比,CIRI組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平均顯著升高(P<0.05);與CIRI組相比,CIRI+si-NC組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平差異無統計學意義(P>0.05);與CIRI組和CIRI+si-NC組相比,CIRI+si-NEAT1組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α水平顯著降低(P<0.05),IL-4、IL-10水平顯著升高(P<0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平比較

2.5 各組大鼠腦組織中lncRNA NEAT1、iNOS、Arg-1、IL-10 mRNA水平比較 與Sham組相比,CIRI組大鼠腦組織中lncRNA NEAT1、iNOS、Arg-1、IL-10 mRNA水平均顯著升高(P<0.05);與CIRI組相比,CIRI+si-NC組大鼠腦組織中lncRNA NEAT1、iNOS、Arg-1、IL-10 mRNA水平差異無統計學意義(P>0.05);與CIRI組和CIRI+si-NC組相比,CIRI+si-NEAT1組大鼠腦組織中lncRNA NEAT1、iNOS mRNA水平顯著降低(P<0.05),Arg-1、IL-10 mRNA水平均顯著升高(P<0.05)(見表5)。

表5 各組大鼠腦組織中lncRNA NEAT1、iNOS、Arg-1、IL-10 mRNA水平的比較

2.6 各組大鼠腦組織中IL-10、STAT3、p-STAT3蛋白水平比較 與Sham組相比,CIRI組大鼠腦組織中IL-10、p-STAT3/STAT3蛋白水平顯著升高(P<0.05);與CIRI組相比,CIRI+si-NC組大鼠腦組織中IL-10、p-STAT3/STAT3蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05);與CIRI組和CIRI+si-NC組相比,CIRI+si-NEAT1組大鼠腦組織中IL-10、p-STAT3/STAT3蛋白水平顯著升高(P<0.05)(見圖4、表6)。

注：A：Sham組;B：CIRI組;C：CIRI+si-NC組;D：CIRI+si-NEAT1組

表6 各組大鼠腦組織中IL-10、p-STAT3/STAT3蛋白水平比較

3 討 論

腦卒中是一種具有較高致死率的急性腦血管疾病,常常伴隨著腦缺血,腦缺血在血液灌流恢復的過程中易發生再灌注損傷[11]。大量研究證明,CIRI過程中會伴隨著神經炎癥反應,抑制神經炎癥活性是治療CIRI的手段之一[12,13]。lncRNA NEAT1在調節基因表達中起著至關重要的作用,具有作為促炎因子的潛力,可影響糖尿病、創傷性腦損傷以及癌癥等多種疾病的病理生理過程[14]。據報道,氧葡萄糖剝奪/復氧(OGD/R)可誘發腦小膠質細胞神經炎癥,而過表達lncRNA NEAT1可加重神經炎癥損傷[15]。Ni等[16]的研究也顯示lncRNA NEAT1在CIRI損傷后調節小膠質細胞活化并促進神經元凋亡。本研究構建CIRI大鼠模型進行體內實驗,結果發現,CIRI大鼠腦組織中lncRNA NEAT1表達升高,提示lncRNA NEAT1可能在CIRI中起重要作用。

當缺血后重新建立血液供應時,炎癥會增加。在神經炎癥過程中,小膠質細胞通過向不同的表型極化執行不同的功能。其一是M1型激活(激活炎癥反應可能對神經細胞產生不利影響);其二是M2型激活(防止過度免疫反應發生,恢復神經元再生,加快腦損傷的恢復)[17]。有報道顯示,敲低lncRNA NEAT1誘導OGD/R處理的小膠質細胞從M1向M2轉移并抑制炎癥反應,為腦卒中治療的潛在靶點[18]。本研究使用Iba1、CD86(M1標記)和CD206(M2標記)作為生物標志物進行免疫熒光染色,結果顯示,CIRI大鼠腦組織Iba1+細胞中CD86+和CD206+的細胞數量顯著升高,表明CIRI會引發小膠質細胞活化。隨后,對CD86/CD206的比值進行統計,CD68/CD206比值高于1表明小膠質細胞向M1表型極化增多。沉默lncRNA NEAT1后,大鼠腦組織中Iba1+CD86+陽性細胞數量、CD86/CD206比值、TNF-α、IL-1β、iNOS mRNA水平顯著降低,Iba1+CD206+陽性細胞數量、IL-4、IL-10、Arg-1水平顯著升高,表明沉默lncRNA NEAT1抑制了小膠質細胞向促炎(M1)表型的極化,促進其向抗炎(M2)表型的極化。

IL-10作為一種抗炎因子,可減弱炎癥因子活性。有研究顯示,IL-10激活STAT3,STAT3被證明在IL-10介導的小膠質細胞抗炎作用中起主要作用[19]。據報道,硫化氫通過調節STAT3通路抑制脂多糖誘導的小膠質細胞促炎反應[20]。本研究結果顯示,沉默lncRNA NEAT1后CIRI大鼠腦組織中IL-10、p-STAT3/STAT3蛋白水平顯著升高,表明lncRNA NEAT1可能通過激活IL-10/STAT3信號通路調節小膠質細胞極化。

綜上所述,沉默lncRNA NEAT1抑制小膠質細胞向促炎(M1)表型的極化并促進小膠質細胞抗炎(M2)表型極化,改善CIRI大鼠腦組織損傷,其作用機制可能與IL-10/STAT3信號通路的激活有關。本研究揭示了lncRNA NEAT1在CIRI后誘導小膠質細胞極化中的作用。但lncRNA NEAT1可能干預的其他信號通路影響小膠質細胞極化,有待深入研究。