miR-24通過PI3K/AKT抑制腦梗死大鼠腦損傷的機(jī)制研究

張科儒, 李 花, 陶 黎, 楊春梅

腦梗死又稱缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke),是因腦部血液供應(yīng)障礙導(dǎo)致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化,發(fā)病的患者有可能會(huì)存在肢體活動(dòng)障礙、言語功能障礙或者是意識(shí)昏迷的現(xiàn)象[1,2]。microRNAs(miRNAs)在缺血性疾病中發(fā)揮重要作用,研究表明miR-24可以降低腦梗死大鼠的血脂[3],通過CDX1/PI3K/Akt通路促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[4],也可以參與糖尿病大鼠血管重構(gòu)[5],同時(shí)本研究前期通過基因芯片篩選腦梗死患者外周血差異基因發(fā)現(xiàn)miR-24是顯著異常表達(dá)的miRNAs之一,因此本研究將進(jìn)一步探究其作用機(jī)制,在大鼠中探究miR-24是否通過調(diào)控PI3K/AKT通路發(fā)揮腦梗死的腦保護(hù)作用,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 SD大鼠 SPF級(jí)SD大鼠,8～10周齡,雄性,體重200～250 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 水合氯醛購(gòu)自天津市申泰化學(xué)試劑有限公司,miR-24 agomiR上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成,蘇木精(H9627),伊紅(861006)購(gòu)于美國(guó)sigma公司,Anti-Bcl-2 antibody (ab194583),Anti-Bax antibody (ab32503),Anti-caspase-3 antibody (ab184787),Anti-PI 3 Kinase catalytic subunit gamma/PI3K-gamma antibody (ab154598),Anti-pan-AKT antibody (ab8805),Anti-AKT (phospho T308) antibody (ab38449),Anti-GAPDH antibody (ab8245)及二抗抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 Leica RM2015切片機(jī),德國(guó)Leica公司,-80 ℃超低溫保存箱,美國(guó)Thermo公司,4 ℃冰箱,購(gòu)自合肥美菱股份有限公司,SC-3610低速離心機(jī),購(gòu)自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司,ABI 7500 qPCR儀,美國(guó)Thermo Fisher公司,Western blot電泳儀,BIO-RAD公司,美國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠分組及飼養(yǎng)條件 50只8～10周齡雄SD大鼠于SPF級(jí)鼠房飼養(yǎng),室溫調(diào)節(jié)在(25±2)℃,相對(duì)濕度40%～65%,12 h/12 h晝夜交替照明,自由攝取食物和飲用水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后造模,本實(shí)驗(yàn)通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核,倫理審查號(hào)：20211383。

1.2.2 大鼠腦梗死動(dòng)物模型的建立 大鼠隨機(jī)分為4組,對(duì)照組隨機(jī)選取10只,假手術(shù)組隨機(jī)選取10只,其他30只建立大鼠腦梗死模型將大鼠消毒后固定,在大鼠頸部前正中線處切開皮膚,采用鈍性分別分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)以及頸外動(dòng)脈(ECA);進(jìn)一步結(jié)扎大鼠ECA,找到遠(yuǎn)心端,使用動(dòng)脈夾夾閉ICA、ECA;在 ECA距CCA 1 cm的分叉處用剪刀剪開,用 MCAO線栓沿ECA緩慢插入ICA,進(jìn)線的深度控制在大約18～22 mm之間,縫合大鼠頸部傷口并消毒;2 h后將露出體外的線栓用剪刀減去,造成再灌注損傷。大鼠完全蘇醒以后,對(duì)所有的大鼠進(jìn)行提尾實(shí)驗(yàn)觀察,造模成功標(biāo)準(zhǔn)為右前肢呈現(xiàn)屈曲的狀態(tài),最終成模率80%,隨機(jī)選取20只用于實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組大鼠操作與模型組一致,僅不予結(jié)扎和插線。模型組大鼠在完成MCAO模型建立2 h后,對(duì)其進(jìn)行腦室內(nèi)立體定向注射miR-24 agomir,以調(diào)控腦部組織內(nèi)miR-24的表達(dá)[6]。

1.2.3 大鼠腦組織HE染色 脊椎脫臼法處死大鼠后,分離各組大鼠腦組織,對(duì)各組大鼠腦組織進(jìn)行固定包埋后切片,脫蠟覆水,蘇木精染色5 min,5%乙酸1 min,伊紅染色1 min,脫水：70%、80%、90%、100%酒精各10 s,二甲苯1 min,通風(fēng)櫥自然晾干再封片,于顯微鏡下進(jìn)行檢查,神經(jīng)元正常且沒有皮質(zhì)水腫記錄為“-”;少數(shù)神經(jīng)元壞死帶有少量皮質(zhì)水腫,梗死面積小于皮質(zhì)總面積的1/3記錄為“+”;少量神經(jīng)元壞死并伴有皮質(zhì)水腫,梗死面積占皮質(zhì)總面積的1/3至2/3記錄為“”;大量神經(jīng)元壞死及皮質(zhì)水腫,梗死面積大于皮質(zhì)總面積的2/3記錄為“”[7]。

1.2.4 大鼠腦組織TTC染色 將各組大鼠腦組織進(jìn)行冠狀切片,然后將各組大鼠腦部切片置于濃度為2%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中,染色20 min,染色后用4%多聚甲醛固定,拍照,分析腦梗死面積[8]。

1.2.5 大鼠腦組織miR-24表達(dá)水平分析 用TRizol提取各組大鼠腦組織mRNA后,立刻按照試劑盒進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行qPCR,引物序列為：miR-24 F-CAGAGATCTAAGTCGTGTGAAATCATGTG,miR-24 R-TAAGTCGACAACAGGGTTTTCCAAGTCTA,U6 F-GTGCAGGGTCCGAGGT,U6 R-CTCGCTTCGGCAGCACA,擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,共40個(gè)循環(huán)。以2-△△Ct計(jì)算miR-24相對(duì)表達(dá)量[9]。

1.2.6 Western blot檢測(cè)大鼠腦組織蛋白的表達(dá) 對(duì)各組大鼠腦組織分離后進(jìn)行液氮研磨,采用RIPA蛋白裂解液細(xì)胞收取總蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE電泳80 vs 15 min,120 vs 2 h, PVDF膜轉(zhuǎn)模120 vs 2.5 h,TBST 漂洗3次每次10 min,使用5%脫脂奶粉封閉,TBST漂洗3次,每次10 min,加入一抗,二抗溫孵育后,TBST漂洗3次,每次10 min,ECL 顯色,發(fā)光儀曝光、拍照[10,11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或KW秩和檢驗(yàn)。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-24對(duì)大鼠腦組織皮質(zhì)病理學(xué)的影響 對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠腦組織的皮質(zhì)區(qū)形態(tài)規(guī)則,極少數(shù)出現(xiàn)已凋亡的神經(jīng)細(xì)胞。模型對(duì)照組大鼠的腦組織皮質(zhì)區(qū)形態(tài)不規(guī)則,凋亡細(xì)胞數(shù)增加,試驗(yàn)組大鼠的腦組織皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)好于模型組,凋亡數(shù)明顯減少(見表1、圖1)。

圖1 各組大鼠腦組織皮質(zhì)HE染色分析(×200)

表1 各組大鼠腦組織皮質(zhì)病理學(xué)分析(只)

2.2 各組大鼠腦梗死面積的比較 對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠腦組織紅色均勻,無腦梗死發(fā)生,模型組出現(xiàn)大面積白色腦梗死區(qū)域;而試驗(yàn)組大鼠相對(duì)于模型組大鼠腦組織腦梗死區(qū)域范圍明顯減少,腦梗死狀況出現(xiàn)明顯改善(見圖2)。

圖2 各組大鼠腦梗死面積的比較

2.3 miR-24在各組大鼠腦組織中的表達(dá)水平 與對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠相比,模型組大鼠腦組織miR-24表達(dá)顯著降低(P<0.05);而試驗(yàn)組大鼠相對(duì)于模型組大鼠miR-24表達(dá)顯著上升(P<0.05),但仍顯著低于對(duì)照組和模型組(P<0.05)(見圖3)。

圖3 miR-24在各組大鼠腦組織中的表達(dá)水平

2.4 各組大鼠腦組織凋亡蛋白caspase-3、Bcl-2、Bax相對(duì)表達(dá)量的比較 與對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠相比,模型組大鼠腦組織caspase-3、Bax蛋白表達(dá)有上升趨勢(shì),Bcl-2蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì)(P<0.01);而試驗(yàn)組大鼠相對(duì)于模型組大鼠caspase-3、Bax有降低趨勢(shì),但仍顯著高于對(duì)照組和模型組(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)有升高趨勢(shì),但仍顯著低于對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.05)(見表3)。

表2 miR-24在各組大鼠腦組織中的表達(dá)水平

表3 各組大鼠腦組織凋亡蛋白caspase-3、Bcl-2、Bax相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 各組大鼠腦組織中PI3K/AKT信號(hào)通路的變化 與對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠相比,模型組大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì),p-AKT蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì)(P<0.01);而試驗(yàn)組組大鼠相對(duì)于模型組大鼠PI3K、AKT有上升趨勢(shì),p-AKT也有上升的趨勢(shì),相對(duì)定量進(jìn)一步驗(yàn)證了這種趨勢(shì)(P<0.01)(見表4、圖4)。

表4 各組大鼠腦組織中PI3K/AKT信號(hào)通路的變化

圖4 大鼠心臟組織Dvl3、GSKβ及β-catenin的蛋白表達(dá)水平

3 討 論

腦梗死多發(fā)于50～60歲以上的中、老年人,男性發(fā)病率高于女性,患者臨床常合并有動(dòng)脈硬化、高血壓、高脂血癥或糖尿病等危險(xiǎn)因素或?qū)?yīng)的全身性非特異性癥狀。腦梗死的前驅(qū)癥狀無特殊性,部分患者可能有一時(shí)性肢體麻木、頭暈、肌肉及四肢無力等短暫性腦缺血發(fā)作的表現(xiàn)。腦梗死發(fā)病通常屬于急癥,具有高致殘率及高致死率的特征,臨床治療原則多為超早期治療,在發(fā)病4.5 h內(nèi)盡可能靜脈溶栓治療,在發(fā)病6～8 h內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)募毙云谘軆?nèi)干預(yù),并依據(jù)患者自身的危險(xiǎn)因素、病情程度等采用對(duì)應(yīng)針對(duì)性治療,結(jié)合神經(jīng)外科、康復(fù)科及護(hù)理部分等多個(gè)科室的努力實(shí)現(xiàn)一體化治療,以最大程度提高治療效果和改善預(yù)后[11,12]。MicroRNA是長(zhǎng)度約為20～24個(gè)核苷酸的一類內(nèi)生的小RNA,在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明,多種microRNA對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞有調(diào)控作用,如miR-124-3p可以通過靶向RhoG抑制多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生存能力和運(yùn)動(dòng)能力,抑制GBM細(xì)胞中的miR-124-3p可上調(diào)RhoG水平并促進(jìn)GBM細(xì)胞的增殖。特異性小干擾RNA序列敲低RhoG表達(dá)部分中和了miR-124-3p抑制劑誘導(dǎo)的效應(yīng)[13,14],但miR-24在神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是腦梗死中得作用尚不清晰,本研究表明,在大鼠腦梗死中,miR-24出現(xiàn)了顯著的下調(diào),過表達(dá)miR-24后,可以顯著抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡,縮小大鼠腦梗死面積,發(fā)揮腦保護(hù)的作用。

PI3K/AKT信號(hào)通路可以調(diào)控多種不同細(xì)胞功能,在包括代謝、生長(zhǎng)、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成等方面發(fā)揮重要作用[15]。研究表明,PI3K/AKT在腦損傷保護(hù)中發(fā)揮重要作用,PI3K/AKT和Nrf2/ARE通路可在缺血性腦組織神經(jīng)保護(hù)和抗氧化作用。本研究表明通過大鼠腦梗死模型證實(shí),腦組織內(nèi)PI3K、AKT及p-AKT均有下降的趨勢(shì);而過表達(dá)miR-24后,大鼠腦組織PI3K、AKT及p-AKT均有上升趨勢(shì),提示出miR-24的調(diào)控與PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵分子PI3K和AKT緊密相關(guān),同時(shí)AKT蛋白的磷酸化修飾在此過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,miR-24可以抑制腦梗死大鼠腦損傷,其機(jī)制于PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控及其磷酸化修飾密切相關(guān)。