P2Y1受體介導星形膠質細胞的激活在急性一氧化碳中毒遲發性腦病中的作用

王雅明, 項文平, 牛翻燕, 岳雅蓉, 付琨燕, 王云霞, 薛 慧

急性一氧化碳(carbon monoxide,CO)中毒在我國發病率非常高,10%～50%患者CO中毒后經過治療會經歷2～60 d的癥狀恢復期,這段時間稱作“假愈期”,之后逐漸出現急性一氧化碳中毒遲發性腦病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP),這是CO中毒后最嚴重的并發癥之一,DEACMP以認知功能障礙、大腦皮質局灶性功能障礙、腦神經損害、錐體系等神經精神癥狀為主要特征[1]。DEACMP的發病機制復雜多樣,因此治療存在困難。目前國內外學者對其發病機制大致歸納為以下幾種學說：缺血缺氧學說、興奮性氨基酸學說[2]、自由基學說[3]、免疫反應學說[4]、細胞凋亡學說[5]、線粒體功能受損[6]等,幾種機制相互作用引起腦功能損傷,最終導致DEACMP,雖然已有眾多相關研究,但結果仍不明確。我們之前研究發現ATP通過P2Y12受體途徑調控的小膠質細胞激活可能導致DEACMP的發生[4],并認為根據DEACMP發病過程的特點從免疫炎癥角度去解釋更加適合,因此本研究將繼續從免疫炎癥角度出發,進一步探索DEACMP的發病機制。

星形膠質細胞是中樞神經系統中數量最多的膠質細胞,是參與神經炎癥反應的關鍵細胞[7]。星形膠質細胞能夠幫助離子和神經遞質處于穩態,維持血腦屏障,同時為神經元提供營養和代謝支持,除此之外在星形膠質細胞上表達有眾多神經遞質轉運蛋白和受體,可以感知和響應突觸傳遞,在大腦中神經元之間信號交換起到至關重要的作用[8]。當中樞神經系統到損傷時,星形膠質細胞被激活使促炎和抗炎因子上調,起到了雙重作用,一方面促進炎癥反應的進展,加重神經組織損傷;另一方面可以釋放神經營養因子,幫助神經組織修復[9]。眾多研究已證實星形膠質細胞是通過P2Y受體的激活來調控的,P2Y受體可以對神經系統病變進行調節。有研究表明P2Y1受體激動劑對星形膠質細胞的刺激顯著減少了創傷性腦損傷模型中的腦水腫和反應性神經膠質增生[10]。與此同時,也有研究發現在阿爾茨海默病(AD)的小鼠模型中通過慢性側腦室注射P2Y1受體拮抗劑可以增強突觸結構的完整性,使星形膠質細胞和神經元網絡功能障礙正?；?改善空間和記憶能力[11],因此P2Y1受體對星形膠質細胞的激活也有著保護和損害的兩面性。目前國內外在DEACMP中尚未有人研究P2Y1受體調控星形膠質細胞能夠產生何種變化,在此,本文將探究P2Y1受體介導的星形膠質細胞激活在DEACMP發病過程的作用與功能。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物及分組 購置150只SD大鼠,雄性,約6周齡,200～250 g[斯貝福北京生物技術有限公司,實驗動物許可證SCXK(京)2019-0010],無特殊病原體級(specific pathogen free,SPF),分籠飼養于恒溫干凈的動物房,提供充足水分和食物,室溫下12 h明暗交替,適應性飼養1周。

1.1.2 主要儀器和試劑 CO氣體(純度99.9%,購于佛山市科的氣體化工有限公司);Morris水迷宮分析系統(購于北京眾實迪創科技發展有限公司);石蠟包埋機、冰凍切片機、普通光學顯微鏡均購于Leica公司;熒光顯微鏡購于OLYMPUS公司。HE染色試劑盒(G1120)、牛血清白蛋白(A8020)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(PC0020)、5xTris甘氨酸電泳緩沖液、10x轉膜液、10xTBST緩沖液、TritonX-100(T8200)均購于北京Solarbio公司;小鼠抗大鼠GFAP抗體(貨號G3893,購于德國Sigma);兔抗大鼠P2Y1抗體(貨號PA5-77678,購于美國Invitrogen);山羊抗小鼠H&L Alexa Fluor 594(貨號ab150116)、山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor 488(貨號ab150077)均購于英國Abcam;小鼠抗大鼠P2Y1抗體(貨號67654-1-lg)、山羊抗小鼠lgG(H+L)(貨號SA00001-1)、GAPDH抗體(貨號60004-1-lg)、靈敏ECL化學發光檢測試劑盒(PL10002)均購于Proteintech武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 實驗動物篩選及分組 160只大鼠飼養1周后進行連續6 d的Morris水迷宮訓練,將大鼠置于水迷宮實驗的平臺上適應數秒,然后將大鼠依次置入水池的4個象限中,直到大鼠成功爬到平臺上,計算機錄入大鼠巡游軌跡和時間,在第7天篩選出合格的大鼠,將逃避潛伏期小于120 s的大鼠視為認知功能正常,進行后續模型制備。按照隨機數字表法將合格大鼠隨機分成空白對照組30只,CO中毒組120只,根據造模后的不同時間節點(7 d、14 d、21 d、28 d)分為4個中毒亞組,每亞組30只大鼠。

1.2.2 模型制備 參照Ochi等[12]的方法采取靜態吸入法創建DEACMP模型,將大鼠置于充滿CO氣體的透明密閉玻璃箱中,CO中毒組先吸入1000 ppmCO氣體40 min,后上調到3000 ppm繼續吸入20 min,如大鼠死亡,立即補入大鼠按相應方法重新操作,確保每組數量相等,對照組置于充滿空氣的箱中60 min。造模成功標準：大鼠呼吸急促沉重,耳朵、爪子和尾巴呈櫻桃紅色,肢體癱瘓及昏迷等,將存活中毒大鼠每個亞組隨機抽取5只進行水迷宮實驗檢測學習和記憶能力和HE染色觀察海馬區錐體細胞損傷情況,兩者同時具備則模型制備成功。

1.2.3 取材及相關指標檢測 將CO中毒組及空白組分別在不同時間節點(7 d、14 d、21 d、28 d)進行標本留取。腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg),一部分大鼠用生理鹽水心臟灌注,沖洗體循環血液,待肝臟轉為陶土色時,用4%多聚甲醛進行腦組織固定,直至肢體僵硬,完整剝離腦組織,后續進行石蠟切片及冰凍切片;其余大鼠麻醉后,斷頭去骨在5 min以內在冰面上快速分離出海馬組織,用預冷生理鹽水涮凈血漬,保存于-80 ℃冰箱中,用于Western blot。(1)HE染色：多聚甲醛固定好的腦組織用石蠟包埋后,切成6 μm厚貼于載玻片上,用試劑盒進行HE染色,中性樹膠封片后在200倍光學顯微鏡下分別觀察各組大鼠海馬CA1區錐體細胞的形態變化。(2)Western blot檢測P2Y1受體和星形膠質細胞特異性標志物GFAP和內參GAPDH蛋白表達情況：海馬組織用超聲波細胞破碎機制備腦組織勻漿,4 ℃離心機離心后取上清液參照BSA法對蛋白含量進行測定,計算出每個樣本上樣體積,配置分離膠、濃縮膠、上樣、電泳、轉膜、封閉,將膜紙用1xTBST進行沖洗,加入稀釋好的一抗P2Y1(1∶2000),GFAP(1∶1000),內參GAPDH(1∶25000),放入4 ℃冰箱搖床上孵育過夜;第22天,再次用1xTBST洗膜3次,10 min/次,分別加入二抗(1∶2000)室溫孵育1 h,再次用1xTBST洗膜3次 ,后置于ECL發光中(1∶1),充分接觸60～120 s,用Image Lab凝膠成像系統進行曝光采集,存儲實驗數據,后期用Image J軟件測定蛋白表達條帶灰度值。(3)免疫熒光檢測P2Y1受體和GFAP表達：將多聚甲醛固定的腦組織,經蔗糖梯度脫水后用冰凍切片機切成18 μm切片,浸泡在PBS溶液中,用0.3%Triton-PBS室溫搖床上漂洗3次,10 min/次;10%山羊血清封閉常溫搖床60 min,孵育一抗GFAP (1∶500)、P2Y1(1∶100),放入4 ℃冰箱搖床上孵育過夜,第2天再用0.3%Triton-PBS室溫搖床上漂洗3次,10 min/次,避光孵育二抗GFAP(1∶400)、P2Y1(1∶100)室溫搖床60 min,后繼續避光用0.3%Triton-PBS漂洗3次,將切片撈出平鋪在載玻片上,用DAPI染色固定細胞核后封片,4 ℃避光保存后續在熒光顯微鏡200倍視野下留取熒光圖片,后期用Image J軟件測定平均光密度。

2 結 果

2.1 Morris逃避潛伏期比較 中毒后各組大鼠水迷宮逃避潛伏期均延長(見圖1),相比對照組,7 d、14 d沒有統計學意義(P>0.05),但中毒21 d、28 d逃避潛伏期明顯延長(P<0.05),空白組組間無統計學差異,以上結果說明在21 d時大鼠發生了行為學上的改變,其記憶力下降顯著,認知功能出現障礙。

圖1 大鼠各組逃避潛伏期(注：與對照組相比有統計學意義aP<0.05)

2.2 各組大鼠海馬CA1區錐體細胞形態比較 在普通光學顯微鏡高倍鏡下對照組海馬CA1區錐體細胞呈多層整齊排列,可觀察到細胞膜結構清晰完整,呈橢圓形,胞質均一染色,胞核明顯呈深藍色,中毒后7 d海馬錐體細胞腫脹,且排列紊亂,細胞數目及層數減少,14 d、21 d、28 d細胞結構不清,細胞皺縮明顯,胞漿濃縮呈深藍色,核固縮、碎裂,甚至發生神經元變性壞死,結合水迷宮結果,可以表明大鼠在21 d時出現DEACMP(見圖2)。

圖2 各組海馬CA1區錐體細胞HE染色對比圖(×200)

2.3 免疫熒光檢測各組大鼠P2Y1和GFAP表達量比較 免疫熒光P2Y1(綠色)、GFAP(紅色)及P2Y1+GFAP(黃色)雙標結果(見圖3)。免疫熒光結果顯示,相對于空白對照組,中毒后的7 d、14 d、21 d、28 d海馬CA1區P2Y1和GFAP都有表達上調,顯著增多,且有統計學意義(P<0.05),各組間免疫熒光平均光密度計數對比(見表1～表3)。

表1 各組間海馬區P2Y1免疫熒光平均光密度計數

表2 各組間海馬區GFAP免疫熒光平均光密度計數

表3 各組間海馬區GFAP+P2Y1免疫熒光平均光密度計數

圖3 各組海馬CA1區P2Y1和GFAP熒光表達情況比較(×200)(因空白對照組各時間點無明顯差異,故僅列出一組空白熒光圖片)

2.4 Western blot檢測各組大鼠P2Y1和GFAP蛋白表達量比較 P2Y1和GFAP在CO中毒各亞組的海馬組織中的蛋白表達量均高于空白對照組(P<0.05),有統計學意義,在CO中毒組中P2Y1和GFAP的蛋白表達趨勢為先逐漸升高后逐漸降低,但CO中毒各亞組間比較無明顯統計學意義。實驗截取的蛋白印記圖(見圖4、圖5)。

圖4 各組間海馬區P2Y1相對蛋白表達量(因對照組在各時間點無明顯差異,故僅列出一個條帶)

圖5 各組間海馬區GFAP相對蛋白表達量(因對照組在各時間點無明顯差異,故僅列出一個條帶)

3 討 論

DEACMP是急性CO中毒最為常見的并發癥之一,該并發癥包括學習和記憶等認知功能障礙,所以本實驗在大鼠中毒前后進行水迷宮實驗,去評估大鼠的認知功能是否發生改變,實驗結果顯示：大鼠的逃避期延長,說明在行為學上發生了DEACMP。有研究表明海馬病變會導致認知功能障礙,同時發現CA1區的神經元病理改變最明顯[13]。所以我們通過HE分別觀察中毒各亞組大鼠海馬組織神經元的形態,發現與對照組相比,CO中毒組海馬CA1區的錐體細胞發生病理改變(14 d、21 d最顯著),結合病理學和行為學兩方面從而去判斷大鼠發生了DEACMP。大鼠海馬區的神經元隨著中毒天數的增加,其變形壞死程度也逐漸加重,這與水迷宮實驗結果大致吻合,和臨床上DEACMP的發病時間也相似。在成功造模的基礎上,我們探究了P2Y1受體對星形膠質細胞的激活是否在DEACMP發病過程中產生了作用,分別通過細胞學層面、蛋白層面去檢測大鼠海馬區P2Y1和GFAP在急性CO中毒后的不同天數是如何變化的。結果表明與對照組相比,中毒各亞組的P2Y1和GFAP的各個層面的表達都有上調,從蛋白表達上看大致趨勢為先逐漸升高后逐漸降低,在7 d～28 d之間有高峰出現,這些數據提示我們P2Y1受體介導的星形膠質細胞的激活可能與DAECMP的發生發展密切相關。

通過免疫熒光我們觀察到星形膠質細胞從胞體分出許多細長突觸,呈星形,它是神經元之間進行信號交換的積極參與者,具有重要的管家功能,如緩沖細胞外空間多余的鉀和神經遞質,維持血腦屏障,為神經元提供必要的營養,并在突觸周圍提供結構支持[8]。當中樞神經系統受損時,炎癥因子可以誘導反應性星形膠質細胞之間形成緊密連接的屏障,限制疾病嚴重程度的進展[14]。近年來星形膠質細胞的激活與認知障礙的關系已成為研究熱點[15～17]。缺血性卒中可導致長期運動和認知功能缺陷,有研究表明星形膠質細胞在缺血性卒中中具有雙重作用,活化的星形膠質細胞提供神經保護并有助于神經恢復,但也分泌炎癥調節劑,導致缺血性病變加重[18]。阿爾茨海默病(AD)進展期間,在轉基因AD小鼠模型中反復皮下施用NLY01可阻斷小膠質細胞介導的反應性星形膠質細胞轉化并保留神經元活力,從而改善空間學習和記憶[19]。Liddelow等人提出星形膠質細胞分為兩種亞型(A1、A2),A1型誘導神經元和少突膠質細胞凋亡;A2型則具有促進神經元存活、生長、突觸形成和吞噬的能力,并表明A1星形膠質細胞在各種人類神經退行性疾病中含量豐富,包括阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病、肌萎縮側索硬化癥和多發性硬化癥[20]。

本研究中,我們發現在DEACMP大鼠模型中,CO中毒組大鼠海馬區星形膠質細胞上調,這種現象可以至少持續到中毒后的第28天,同時隨著時間進展發生了認知功能障礙,這些結果表明在海馬區大量積累了星形膠質細胞,活化的星形膠質細胞可能在DEACMP的發展過程中起到了一定作用。

星形膠質細胞膜表面表達多種神經遞質轉運蛋白和受體,使其感知和響應突觸活動,其中就包括P2Y受體,P2Y受體是三磷酸腺苷(ATP)等核苷酸的生理性受體,而ATP介導短期鈣信號事件和膠質細胞的長期增殖、分化和死亡[21]。當中樞神經系統(central nervous systenm,CNS)受到缺血應激時,誘導ATP上調使P2受體/蛋白激酶級聯被激活,導致膠質細胞的晚期反應,包括星形膠質細胞的增殖(膠質瘢痕)和少突膠質細胞的白質脫髓鞘[22]。神經系統疾病多會導致認知缺陷,有研究通過使用P2Y1基因敲除的小鼠進行局灶性缺血造模,其結果表明神經膠質細胞上的P2Y1受體參與海馬炎癥反應[23]。已有眾多研究表明,P2Y1R可以介導星形膠質細胞對CNS產生有利或有害的作用。Wellmann等人在癲癇大鼠模型中通過使用MRS2179 阻斷P2Y1R通過降低慢速Ca2+瞬變的頻率來減少星形膠質細胞Ca2+振蕩的平均持續時間,使癲癇癥狀得到改善[24]。緊隨其后,Martorell等人也通過使用特異性拮抗劑MRS2179抑制嘌呤能P2Y1受體,逆轉了癲癇導致的損傷,得出結論：P2Y1R抑制挽救了星形膠質細胞Ca2+的模式以及癲癇患者海馬中CA3～CA1突觸的活性和可塑性,提示星形膠質細胞可能參與了導致突觸可塑性惡化,從而導致癲癇患者認知能力下降的機制[25]。Guo等人通過體外培養大鼠皮質星形膠質細胞,使用P2Y1R拮抗劑顯著減輕鈣信號通路對氧和葡萄糖剝奪誘導的星形膠質細胞損傷[26]。與此同時在同樣為認知障礙性疾病的阿爾茲海默病中也發現了阻滯P2Y1受體可以使星形膠質細胞正常化和學習記憶功能得到改善[11]。Shi[27]等人發現在AD的后期階段,P2Y1嘌呤受體在AppNL-F/NL-F 小鼠的CR細胞和星形膠質細胞中“上調”并強烈表達,并認為通過調節上調的嘌呤受體系統來糾正抑制性內穩態的破壞,可能作為一種AD的新的治療策略。以上眾多研究得到的結論提示我們P2Y1對星形膠質細胞的激活對機體的作用成雙刃劍,在一定程度上起到保護作用,如果超過限度可能就會產生損害。

本研究采用靜態吸入法進行DEACMP造模,此造模方法符合現實生活中CO中毒過程,與腹腔注射法相比更具代表性,奠定了本實驗成功的基礎,通過實驗我們發現大鼠急性CO中毒后不同天數(7 d、14 d、21 d、28 d)其海馬區P2Y1R和星型膠質細胞與空白組相比表達均增高,Western blot結果提示,CO中毒組P2Y1受體與星型膠質細胞蛋白表達均上調,且與對照組相比均有統計學意義;免疫熒光結果同樣證實GFAP與P2Y1受體與空白組相比顯著增加,也具有統計學意義,所有實驗方法的CO中毒組間均無統計學意義,這些結果提示我們CO中毒后啟動P2Y1受體途徑去激活星型膠質細胞活化,可能參與了DEACMP的發生發展。我們前期研究證實CO中毒后星型膠質細胞及其下游的炎癥因子(TNF-α、IL-b、IL-6)的濃度顯著升高,且與對照組相比有統計學差異。

有研究提出星型膠質細胞參與的免疫炎癥反應是多種退行性疾病的認知障礙病理過程的重要環節,表現為星型膠質細胞活化和其分泌的炎癥因子水平增高[28]。在一定的程度上CNS受到損傷時會啟動免疫炎癥反應激活星型膠質細胞產生炎癥因子去修復神經元,但如果持續作用就會反應過度加劇神經元壞死,導致脫髓鞘、神經炎癥因子累積及細胞壞凋亡[29]。之前,尚未有人研究P2Y1受體介導星型膠質細胞在DEACMP中如何發揮作用,在此根據實驗結論我們猜想在中毒后P2Y1受體與星型膠質細胞持續表達(直到28 d),其下游炎癥因子不斷累積作用于神經元,可能會加劇神經元的損傷甚至凋亡使認知功能受損最終導致DEACMP的發生,但本實驗未檢測中毒7 d之前P2Y1和GFAP是如何表達的,其前期是否起到了保護作用有待我們接下來進一步驗證。

4 結論與展望

我們得出的結論是P2Y1受體及星型膠質細胞與DEACMP的發生發展具有相關性。本研究初步探索了P2Y1受體介導星型膠質細胞在DEACMP中的表達變化,旨在為DEACMP病理機制提供一些新思路。因本實驗時間有限仍存在許多不足,我們后續將會深入探索該通路的具體作用機制。本研究未檢測CO中毒后7 d內各蛋白表達水平,后續將會把時間細分研究其各時間點的變化及產生何種作用;同時,我們計劃使用P2Y1受體拮抗劑去進一步驗證P2Y1受體介導星型膠質細胞能否導致DEACMP的發生;我們希望在該實驗的基礎上,進行星型膠質細胞體外培養,有針對性地觀察其下游因子的濃度變化;最后我們希望通過研究進一步闡明DEACMP的病理機制,為臨床DEACMP的治療提供新的理論依據,以更好地防止DEACMP的發生。