不同DAB 顯色液對免疫組化結(jié)果的對比分析

陳潔 章詩偉

（湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科 湖北武漢 420000）

免疫組織化學是一種常見的病理技術(shù)，是應用免疫學原理，基于抗原抗體特異性反應，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究，又稱為免疫細胞化學技術(shù)（IHC）。許多疾病除了依靠組織形態(tài)外，還必須依靠免疫組化[1-3]才能明確診斷。而免疫組化步驟較多，除了常規(guī)組織固定、抗體的選擇可能影響免疫組化結(jié)果外[4-5]，顯色作為最后一步，DAB 顯色液的優(yōu)劣也能直接影響免疫組化結(jié)果。因此，既要得到最優(yōu)的結(jié)果，又能使成本得到控制。基于此，將DAB試用裝與現(xiàn)用的顯色液進行對比，觀察試用裝顯色效果，判斷能否代替現(xiàn)用的顯色液，達到降低成本的目的。

1 材料與方法

1.1 設備

切片機、一次性刀片、高壓鍋、免疫組化專用孵育盒、烤箱、奧林巴斯顯微鏡。

1.2 試劑

脫蠟劑、EDTA（濃縮型）、無水酒精、95%酒精、去離子水、PBS 粉末、吐溫-20、蘇木素、0.5%鹽酸酒精、中性樹膠等。

1.3 其他

洗瓶、黏附載玻片、蓋玻片等。

1.4 材料

選擇2021 年5 月1 日～2021 年12 月30 日的蠟塊并切白片，其中不同宮頸組織并切6 張白片（p16、Ki-67、HPV 各2 張）、胃鏡組織切14 張白片（PCK、CDX2、CD38 各4 張，Calponin2 張）、結(jié)腸活檢組織2 張 (均PCK) 及腎上腺穿刺組織4 張（CD20、Ki-67 各2 張），相同組織白片隨機分為兩組，分別為A 組（試用裝）和B 組（現(xiàn)用裝）。

1.5 免疫組化流程

（1）切片及烤片：用免疫組化專用黏附載玻片，切片厚度3 微米，烤片65℃、120 分鐘。

（2）脫蠟：專用脫蠟劑2 缸，均37℃、10 分鐘/缸，然后依次經(jīng)過無水酒精2 缸、95%酒精1 缸、80%酒精1 缸。大約0.5 分鐘/缸。

（3）沖洗：自來水沖洗后先用去離子水洗2 次，3分鐘/次。然后用1×PBST沖洗，3分鐘/次，共3次。

（4）高壓修復：EDTA 高壓修復2.5 分鐘。修復結(jié)束后，待鍋內(nèi)的液體降至常溫后，用免疫組織化學專用筆劃線，1×PBST 沖洗，3 分鐘/次，共3 次。

（5）內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑：常溫孵育約10分鐘。1×PBST 沖洗3 次，3 分鐘/次。

（6）一抗：甩干殘余液體，在同編號的白片上滴加相同的適量抗體，使組織被充分覆蓋，37℃孵育50 分鐘。孵育結(jié)束后1×PBST 沖洗3 次，3 分鐘/次，甩干。

（7）二抗：室溫孵育30 分鐘。孵育結(jié)束后用1×PBST 沖洗3 次，3 分鐘/次。

注：圖A：試用裝；圖B：現(xiàn)用裝。圖片均×40 倍。圖1：胃活檢組織，A 圖中腺體顯色略淺，而B 圖顯色稍深，看不到清晰的腺體。此外，由于B 圖顯色偏深，使得背景顏色整體偏暗。圖2- 圖3：均為宮頸組織。圖2A 的宮頸上皮及圖3A 基底層細胞顯色均連續(xù)，圖3B 局部存在非特異性著色。圖4- 圖6：胃活檢組織。兩組陽性區(qū)域略有差異。圖4B 存在非特異性著色導致腺體結(jié)構(gòu)不清。

（8）顯色液配制：按照說明書配制兩種顯色液，輕輕吹打混4℃?zhèn)溆谩?/p>

（9）顯色：分別滴加顯色液適量，B 組7 分鐘后終止顯色，A 組在顯微鏡下觀察，根據(jù)對照，染色時間約在5.5 分鐘時終止顯色。

（10）復染：相同的切片一起復染。蘇木素2 分鐘，自來水沖洗，0.5%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍，甩干殘余水分后無水酒精內(nèi)靜置約1 分鐘，冷風吹干。

（11）封片及結(jié)果判讀。

2 結(jié)果

2.1 觀察指標

觀察兩組切片陽性區(qū)域是否一致，是否存在背景著色、非特異性染色等。

2.2 結(jié)果

整體來看，兩組切片陽性區(qū)域基本保持一致。但是，不同組織的局部區(qū)域染色稍有差異（具體見圖1-圖6 所示，圖片均×40）。圖1：橫結(jié)腸活檢組織（PCK），A 圖中腺體顯色略淺，而B 圖顯色稍深，看不到清晰的腺體結(jié)構(gòu)。此外，由于B 圖顯色偏深，使得背景顏色整體偏暗。圖2-圖3：均為宮頸組織，依次為HPV 及Ki-67。圖2A 的宮頸上皮及圖3A 基底層細胞顯色均連續(xù)，此外，圖3B 局部存在非特異性著色。圖4-圖6：均為胃黏膜活檢組織，依次為CDX2、CD38、Calponin。兩幅圖對比發(fā)現(xiàn)A 圖中局部呈現(xiàn)陽性區(qū)域的地方，在B 圖中僅為部分區(qū)域顯色，而且著色整體偏淺。

3 討論

DAB，又稱4,4-二氨基聯(lián)苯胺，多環(huán)芳香胺的衍生物，是免疫組化常用的顯色液，是世界衛(wèi)生組織公布的1 類致癌物。它主要是和蛋白質(zhì)的NH2或SH 集團結(jié)合，形成穩(wěn)定的N-N 或N-S 鍵后呈棕黃色，繼而對目標蛋白進行定位。本次實驗發(fā)現(xiàn)，雖然試用裝的DAB 顯色液顯色效果比現(xiàn)用的顯色液顯色偏深，但是無背景色及非特異性著色。A 組試用的DAB 顯色液可以通過多次摸索找到最佳顯色時間。此外，雖然有些顯色區(qū)域有差異，但是不是目標區(qū)域，并不會影響最終診斷。那么，為什么不同的顯色液，其顯色的深淺有差異呢？這或許除了跟顯色時間有關(guān)，還跟不同的顯色液中DAB 的濃度及其溶液的PH 值有關(guān)系[6-8]。那么，接下來，關(guān)于試用裝DAB 顯色偏深的問題，可以摸索合適的濃度及顯色時間。

綜上所述，試用裝DAB 可以取代現(xiàn)用的顯色液運用到日常工作中，達到降低成本的目的。