16S rDNA克隆文庫法分析小龍蝦腸道細菌多樣性

鄭居神，何浣紗，胡奧，石玉，馮光志*

武漢設計工程學院食品與生物科技學院（武漢 430205）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），俗稱小龍蝦，20世紀20年代由日本傳入我國，并迅速在我國廣泛傳播[1-2]，到20世紀70年代，伴隨小龍蝦飲食文化的興起，小龍蝦養殖產業開始飛速發展，使得我國迅速成為世界上最大和最重要的小龍蝦生產國[3-4]。

小龍蝦產業取得長足發展，但伴隨小龍蝦養殖規模和經濟體量的不斷增長，養殖過程中存在的一些問題開始顯現，進而推動小龍蝦規模養殖的相關科學研究。這些研究主要集中于小龍蝦的行為學、養殖密度、疾病和免疫及飼料中蛋白質、脂肪配比等方面[5]。隨著研究的不斷深入，科研工作者開始對小龍蝦腸道微生物逐漸重視起來，腸道微生物在水產動物生長代謝、營養吸收以及免疫抗病等方面發揮重要作用[6]，與小龍蝦的健康息息相關[7]。

小龍蝦的健康與其腸道微生物的菌群結構密不可分。王飛飛等[8]采用高通量測序技術，對稻蝦共作模式下克氏原螯蝦腸道中菌群多樣性進行研究，結果發現克氏原螯蝦腸道中優勢細菌種類為厚壁菌門（42.16%）、變形菌門（13.78%）和柔膜菌門（13.07%）。李飛等[9]采用高通量測序方法分析2種養殖模式下克氏原螯蝦腸道的微生物多樣性和群落結構，結果顯示池塘和稻田養殖克氏原螯蝦腸道微生物在物種組成上、多樣性上都存在明顯差異。高通量測序技術因其能完整反映測試樣品的菌群結構特征，是研究微生物菌群結構的重要工具[10]，而16S rDNA克隆文庫法技術成熟，可操作性好，在反映優勢菌群方面具有一定優勢[11]。鑒于此，試驗采用16S rDNA克隆文庫法，對小龍蝦腸道共生細菌進行系統發育分析，通過揭示小龍蝦腸道微生物優勢菌群，探討這些微生物在食物消化過程中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

小龍蝦（實驗室蝦池人工養殖）。

1.2 培養基及試劑

LB液體培養基：取10 g胰蛋白胨、5 g酵母抽提物、10 g氯化鈉，用蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌至完全溶解，于1×105Pa滅菌20 min。X-Gal：取25 mg固體X-gal溶解于1 mL的二甲基甲酰胺中，于-20 ℃避光保存。IPTG：稱取250 mg IPTG溶解于10 mL去離子水中，抽濾分裝后，于-20 ℃貯存。PCR引物的合成及測序由上海桑尼生物科技有限公司完成。限制性內切酶Afa Ⅰ和MspⅠ、Taq酶、dNTP、pGEM-T Vector等（購于TaKaRa公司）；DNA提取試劑盒、PCR純化試劑盒（購于天源公司）。

1.3 CTAB法提取小龍蝦腸道總DNA

采用CTAB法提取小龍蝦腸道的總DNA，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度。

1.4 小龍蝦腸道細菌16S rDNA的擴增

以提取的小龍蝦總DNA為模板，利用細菌16S rRNA基因通用引物27F，1492R進行PCR擴增。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行30個循環，72 ℃延伸7 min。

1.5 小龍蝦腸道共生細菌16S rRNA基因文庫的構建

PCR結束后，將純化后的PCR產物與pGEM-T easy載體在4 ℃條件下進行連接過夜，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取平板上陽性克隆，以M13為引物進行PCR擴增，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證序列是否正確插入，片段在1 700 bp左右。對插入正確序列的克隆分別采用限制性內切酶Afa Ⅰ和MspⅠ這2種酶進行酶切，酶切產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，對酶切圖譜進行限制性片段長度多態性分析。若同一克隆2種酶的酶切圖譜相同則歸為一類，稱之為相同的克隆型。從具有相同克隆型的克隆中選取1～2個克隆送上海桑尼公司測序。

1.6 序列分析與系統發育樹的構建

序列經DNAstar軟件分析后，通過NCBI的BlastN搜索同源性較高的已知序列，利用MEGA 4.0軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 小龍蝦腸道共生細菌16S rDNA的PCR擴增

以小龍蝦的總DNA為模板，用細菌通用引物27F，1492R進行PCR擴增，得到約1 500 bp的條帶，與預期的大小一致。

2.2 小龍蝦腸道共生細菌16S rDNA文庫的建立

隨機挑取平板上大腸桿菌DH5α白色菌落，以M13為引物，進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測得到共計369個含有正確插入序列的克隆，分別用限制性內切酶AfaⅠ（圖1）和MspⅠ（圖2）對所得到的這369個含有正確插入序列的克隆進行酶切，并進行限制性片段長度多態性分析。根據核糖體DNA擴增片段限制性內切酶分析（ARDRA），將這369個陽性克隆分為35個不同的ARDRA型，其中AfaⅠ共得到19種克隆型，MspⅠ共得到16種克隆型。

圖1 小龍蝦腸道共生細菌16S rDNA PCR產物的Afa Ⅰ的部分酶切圖譜

圖2 小龍蝦腸道共生細菌16S rDNA PCR產物的MspⅠ的部分酶切圖譜

2.3 小龍蝦腸道共生細菌的系統發育分析

將35種克隆型分別隨機挑取1～2個克隆測序，并將序列相似性大于99.5%的克隆視為相同克隆型，最終得到24個不同的克隆型，將得到的這24個細菌16S rRNA基因序列在GenBank數據庫中進行BLAST分析，結果顯示小龍蝦腸道共生細菌的16S rRNA基因分別與檸檬酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌屬、巨型球菌屬、中慢生根瘤菌屬、Brachymonas、Sinanaerobacter、Cyanobium、丹毒絲菌屬細菌的16S rDNA序列最為接近，相似性為83.6%～99.4%。在系統發育樹（圖3）上，各個克隆分別形成不同的簇，說明小龍蝦腸道微生物多樣性非常豐富。有些克隆序列與Genbank中最相近序列的相似性低于95%，可能是迄今尚未描述的新種。

圖3 基于16S rDNA的小龍蝦腸道共生細菌的系統發育分析

3 討論與結論

腸道菌群結構復雜，種類繁多，但大體可以劃分為3種類型：共生菌群，占腸道菌群的絕大部分，這些微生物多是益生菌，和宿主一起行使多種生理功能；條件致病菌群，當宿主處于健康狀態時，這些微生物很安分，能夠和宿主和平相處，但當宿主處于病變狀態，腸道菌群發生紊亂時，條件致病菌就會引發多種腸道疾病；致病菌群，通常經過環境進入腸道，導致病變。腸道微生物在維持宿主健康中發揮重要作用，腸道菌群結構對宿主健康具有指示作用。賈麗娟等[12]通過高通量測序技術研究武漢地區的克氏原螯蝦腸道的優勢菌屬，結果為檸檬酸桿菌屬、氣單胞菌屬和Anaerorhabdus furcosagroup等。試驗從小龍蝦腸道共生細菌中得到的24個16S rRNA基因序列，分別歸于檸檬酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌屬等12個屬，與賈麗娟等[12]的研究一致，說明小龍蝦腸道具有相對固定的菌群結構，可考慮篩選指示小龍蝦健康狀況的細菌種群。

腸道微生物棲居于宿主腸道內，與宿主形成共生關系，作為宿主體內最龐大最復雜的微生態系統，腸道微生物及其代謝產物不僅能調節宿主健康，在宿主消化與代謝、疾病與免疫等方面都發揮著重要作用[13]。關于腸道微生物的研究，主要集中在3個方面：一是腸道微生物群落的結構及其演替規律[14-16]；二是腸道微生物菌群結構的影響因素[17]；三是腸道微生物的生理功能[18]。這些研究主要還是集中在人、小鼠及斑馬魚等生物上，關于小龍蝦腸道微生物方面的研究還較少，且多集中于腸道微生物群落結構及其影響因素方面。腸道微生物與小龍蝦的生理健康息息相關，研究腸道微生物的菌群結構和生理功能，對小龍蝦養殖和飼料配方的研制都具有極其重要的作用。試驗從小龍蝦腸道得到24個細菌16S rDNA序列，系統發育分析表明，這些克隆分別與檸檬酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌屬、巨型球菌屬、中慢生根瘤菌屬、Brachymonas、Sinanaerobacter、Cyanobium、丹毒絲菌屬細菌的16S rDNA序列最為接近。這些屬的細菌中有很多具有產酶能力，如：巨型球菌屬微生物產淀粉酶、蛋白酶；擬桿菌屬細菌能夠分解糖和蛋白質[19]；檸檬酸桿菌屬微生物能利用檸檬酸鹽，發酵葡萄糖；希瓦菌屬降解染料[20]；梭菌屬細菌可以發酵糖、醇和其他有機物；Sinanaerobacter能降解乙草胺和丁草胺等[21]。這些腸道微生物在輔助小龍蝦消化食物的過程中發揮著不可替代的作用，可能還存在許多的新種，它們行使的生理功能和作用機制仍有待深入探究，同時，小龍蝦腸道中也存在一定比例的條件致病菌，如丹毒絲菌屬[22]、希瓦氏菌屬微生物[23]，在一定條件下可導致小龍蝦致病，為維持和改善小龍蝦腸道菌群結構，投喂微生物制劑是行之有效的辦法。