QuEChERS-UPLC-MS/MS同時測定植物源保健食品中15種農(nóng)藥殘留

耿熠博，袁利杰*，王祥，郭立凈

1.河南省食品檢驗研究院（鄭州 450003）；2.國家市場監(jiān)管重點實驗室（食品安全快速檢測與智慧監(jiān)管技術）（鄭州 450003）；3.特殊食品工程技術研究中心（鄭州 450003）

隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對養(yǎng)生保健的需求日益增多，許多保健食品應運而生[1-3]。植物源保健食品是以藥食同源類中藥材為原料的保健食品，使用較多的原料有決明子、白芍、蘆薈、三七、菊花、枸杞等。

近年來，隨著中藥材種植面積的擴大，不少種植戶盲目噴灑化學農(nóng)藥，亦或者通過土壤、水體轉(zhuǎn)移、富集農(nóng)藥，造成保健食品原料的污染[4-10]。2019年8月16日，國家藥典委發(fā)布《0212藥材和飲片檢定通則公示稿》，規(guī)定禁用33種農(nóng)藥[11]，但是缺少保健食品中農(nóng)藥殘留的相關標準規(guī)定。

國內(nèi)外對農(nóng)藥殘留的文獻報道中，檢測方法主要包括液相色譜法（liquid chromatography，LC）[12-14]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[15-18]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）[19-21,28]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[22-25,29]和氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜[26-27]。由于植物源保健食品基質(zhì)復雜，會產(chǎn)生較強的基質(zhì)干擾，試驗以市場上常見的6類保健食品作為研究對象，選擇15種監(jiān)測風險較高的農(nóng)藥殘留進行研究，以常見的3種劑型，即片劑、膠囊和液體為基質(zhì)，旨在建立一種簡單、快捷的檢測方法，以滿足大批量樣品檢測，同時為植物源保健品農(nóng)藥殘留的檢測提供方法依據(jù)，為植物源保健食品的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

根據(jù)國家食品安全監(jiān)督抽檢實施細則，在河南省不同區(qū)域采集131批次保健食品樣品，包括通便類49批次、減肥類8批次、清咽類35批次、緩解體力疲勞/增強免疫類8批次、降血糖/降血壓類19批次、促進消化類12批次，采樣地點為生產(chǎn)企業(yè)的成品庫，流通環(huán)節(jié)的網(wǎng)購、批發(fā)市場、專賣店、藥店、超市和其他。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290-6470超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]；4-16KS高速冷凍離心機（德國SIGMA）；ME203電子天平、Mettler XS205電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；UMV-1多管振蕩器（成都萊普科技有限公司）。

1.3 材料與試劑

15種農(nóng)藥標準物質(zhì)：3-羥基克百威、吡蟲啉、多菌靈、吡蚜酮、啶蟲脒、涕滅威砜、唑蟲酰胺、滅多威、霜霉威、敵百蟲、甲氨基阿維菌素（100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所）；甲基硫菌靈（97.6%）、硫線磷（98.2%）、噻蟲嗪（99.4%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；辛硫磷（99.8%，北京曼哈格生物科技有限公司）。

甲酸銨、甲酸、甲醇（質(zhì)譜純，德國Merk公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉二水合物、檸檬酸二鈉倍半水合物、乙酸鈉（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；0.22 μm濾膜（有機系，天津市領航實驗設備股份有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理

1.4.1.1 片劑

稱取2 g粉碎后試樣于50 mL離心管中，加入10 mL水渦旋，靜置30 min。加入10 mL 1%乙酸-乙腈及1顆陶瓷均質(zhì)子，振蕩1 min，加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉，再次劇烈振蕩1 min后，以5 000 r/min離心5 min，移取2 mL上清液至凈化管中[每毫升提取液使用150 mg無水硫酸鎂、50 mg C18和50 mgN-丙基乙二胺（PSA）]，上清液過微孔濾膜，待測定。

1.4.1.2 膠囊劑（內(nèi)容物）

稱取2 g試樣于50 mL離心管中，加入5 mL水、10 mL 1%乙酸-乙腈及1顆陶瓷均質(zhì)子，振蕩1 min后加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉二水合物和0.5 g檸檬酸二鈉倍半水合物，再次振蕩1 min后，以5 000 r/min離心5 min。移取2 mL上清液至凈化管中（每毫升提取液使用150 mg無水硫酸鎂、50 mg C18和50 mg PSA），上清液過微孔濾膜，待測定。

1.4.1.3 液體

準確稱取2 g試樣，置于50 mL離心管，用1%乙酸-乙腈定容至10 mL，過微孔濾膜，待測定。

1.4.2 基質(zhì)標準溶液的制備

將15種標準物質(zhì)用甲醇溶解或稀釋，配制成質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的標準品混合使用液。選擇不含有目標檢測物的類似樣品，按照試驗前處理方法處理，得到空白基質(zhì)溶液。精確吸取一定量混合標準溶液，用空白基質(zhì)溶液，將其稀釋成質(zhì)量濃度為0.001，0.002，0.005，0.010，0.020，0.050和0.100 μg/mL的系列基質(zhì)匹配標準工作液。

1.4.3 儀器條件

1.4.3.1 色譜條件

色譜柱C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35 ℃；進樣體積2 μL；流速0.3 mL/min；流動相A為2 mmol/L甲酸銨-甲酸水溶液，流動相B為2 mmol/L甲酸銨甲醇溶液；梯度洗脫：0～1.5 min，5% B；1.5～3.5 min，5%～30% B；3.5～5.5 min，30%～95% B；5.5～7.5 min，95% B；7.6 min，5% B。

1.4.3.2 質(zhì)譜條件

離子源類型為電噴霧離子源；掃描方式為正離子；電噴霧電壓為正離子5 500 V；離子源溫度350 ℃；霧化氣0.345 MPa。15種農(nóng)藥的質(zhì)譜信息見表1。

接表1

2 結果與分析

2.1 儀器分析條件的優(yōu)化

試驗考察Agilent ZOBAX XDB C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Phenomenex C18110?（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）3個品牌的C18色譜柱，結果發(fā)現(xiàn)分離度均比較好，沒有顯著性差異。

分別選取0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸溶液（含2 mmol/L甲酸銨）作為水相，甲醇、乙腈、甲醇（含2 mmol/L甲酸銨）和乙腈（含2 mmol/L甲酸銨）作為有機相進行考察，結果發(fā)現(xiàn)，流動相為0.1%甲酸（含2 mmol/L甲酸銨）溶液和甲醇（含2 mmol/L甲酸銨）時，各物質(zhì)響應強度明顯高于流動相為0.1%甲酸水溶液和純有機相的強度，且峰型拖尾現(xiàn)象得到明顯改善；與乙腈作為有機相相比，甲醇能在更短時間內(nèi)使待測組分得到有效分離。因此，試驗選擇0.1%甲酸（含2 mmol/L甲酸銨）溶液和甲醇（含2 mmol/L甲酸銨）為流動相進行梯度洗脫，標準物質(zhì)提取的離子色譜圖見圖1。

圖1 標準物質(zhì)提取的離子色譜圖

提取的離子色譜圖顯示，15種農(nóng)藥的保留時間處均沒有干擾峰，表明方法專屬性較強。在陰性樣品中添加15種農(nóng)藥，質(zhì)量濃度均為100.00 μg/L，按照1.4.1操作，15種農(nóng)藥提取的離子色譜圖分離良好，單次測定15種農(nóng)藥在8 min之內(nèi)完成分離。

2.2 提取溶劑的選擇

試驗考察水、甲醇、乙腈、乙醇、1%甲酸-乙腈、1%乙酸-乙腈、1%氨水-乙腈7種提取溶劑體系，通過在植物源保健食品的片劑、膠囊劑和液體3種空白基質(zhì)中加入適量標準溶液，計算回收率，結果見圖2。結果表明膠囊劑和液體劑型的植物源保健食品中乙腈和1%甲酸-乙腈的提取回收率沒有差異，均能達到80%以上。對片劑樣品，1%甲酸-乙腈的提取回收率優(yōu)于乙腈的回收率。綜合考慮，選擇1%乙酸-乙腈為提取溶劑。

圖2 不同提取方法對于片劑保健食品的15種農(nóng)藥的回收率

2.3 凈化步驟的優(yōu)化

試驗考察C18、PSA凈化材料單獨使用與組合使用對待測物回收率的影響。因液體保健食品基質(zhì)相對較簡單，故不對其進行凈化，僅對片劑和膠囊的凈化效果進行考察。具體步驟：在2.2小節(jié)的優(yōu)化提取條件下，提取完成后以10 000 r/min離心，取上清液至裝有150 mg無水硫酸鎂和不同凈化材料的2 mL離心管中，渦旋離心后過濾膜檢測，通過計算15種農(nóng)藥的回收率考察不同凈化材料的吸附情況，結果見圖3和圖4。結果顯示，C18與PSA組合使用凈化效果較好，最終選擇50 mg C18+5 mg PSA作為凈化劑。

圖3 不同凈化材料對于片劑保健食品的15種農(nóng)藥的回收率

圖4 不同凈化材料對于膠囊保健食品的15種農(nóng)藥的回收率

2.4 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應是使用LC-MS/MS檢測殘留應盡量避免的。據(jù)文獻[30-31]報道，基質(zhì)效應案式（1）計算。

基質(zhì)效=A/B（1）

式中：A為在純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的響應值；B為樣品基質(zhì)中添加的相同含量農(nóng)藥的響應值。

基質(zhì)效應為1時，表示無基質(zhì)效應；基質(zhì)效應大于1時，表示樣品基質(zhì)對目標化合物的測定存在基質(zhì)抑制作用；基質(zhì)效應小于1時，表示樣品基質(zhì)對目標化合物的測定存在基質(zhì)增強作用。通過比較15種農(nóng)藥的基質(zhì)效應，結果發(fā)現(xiàn)除吡蟲啉外的所有農(nóng)藥均是較為顯著的基質(zhì)抑制效應（見表2），基質(zhì)效應的值均大于1，因此為消除基質(zhì)效應帶來的影響，必須采取基質(zhì)標曲進行校正。

2.5 線性關系及定量限

以定量子離子的色譜圖峰面積（Y）為縱坐標，以對應的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程、線性相關系數(shù)、定量限見表2。結果顯示，15種農(nóng)藥在0.001～0.1 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)（r2）均大于0.996，可通過線性方程對樣品基質(zhì)中農(nóng)藥含量進行準確定量。15種農(nóng)藥方法定量限（limit of quantification，LOQ）按最低質(zhì)量濃度點0.1 μg/mL的響應值與空白樣品基質(zhì)中的噪聲響應值的10倍計算，結果為0.005～0.02 mg/kg，可滿足植物源保健食品中農(nóng)藥的檢測。

表2 農(nóng)藥線性方程、基質(zhì)效應、相關系數(shù)以及定量限

2.6 方法準確度和精密度

在不含目標檢測物的消化類保健食品片劑中添加適量混合標準工作液，分別制成0.005，0.100和0.500 mg/kg 3個水平的空白添加樣品，每個添加水平做6次平行試驗，以加標的回收率表示方法的準確度，按照試驗方法處理分析，分別進行分析測定，15種農(nóng)藥在植物源保健品中不同濃度的回收率及精密度見表3。結果顯示，15種農(nóng)藥在0.005 mg/kg的添加水平下，回收率為82%～107.3%，相對標準偏差（relative standard deviation，SRSD）為2.9%～9.1%（n=6），在0.1 mg/kg的添加水平下，回收率為83.5%～101.6%，SRSD為3.5%～8.9%（n=6），在0.5 mg/kg的添加水平下，回收率為92.4%～103.4%，SRSD為2.5%～9.7%（n=6）。在不同的添加水平下，樣品基質(zhì)中的重現(xiàn)性與平行性均較好，可滿足多種樣品基質(zhì)大批量檢測的需求。

表3 農(nóng)藥加標回收率及精密度（n=6）

接表3

2.7 樣品分析

按上述檢測方法，對6類共計131批保健食品進行檢測，結果顯示除促進消化類保健食品中未檢出農(nóng)藥殘留外，其他5類均有多種農(nóng)藥殘留檢出，檢測結果見表4～表6。檢測結果顯示：131批次保健食品中有119批次有農(nóng)藥殘留檢出，檢出率為90.8%，檢出農(nóng)藥殘留種類有9種，3-羥基克百威、吡蚜酮、硫線磷、滅多威、涕滅威砜、辛硫磷在6類保健食品中均未檢出，甲氨基阿維菌素檢出率最高，達到90.8%，其次為甲基硫菌靈，檢出率為33.6%，其他農(nóng)藥殘留檢出率在0.8%～14.5%之間。結果表明試驗方法方便、快速，靈敏度較好，可實現(xiàn)植物源保健食品中多種農(nóng)藥殘留的檢測。

表4 通便類、減肥類檢測結果

表5 清咽類檢測結果

表6 降血糖/降血壓類、緩解體力疲勞/增強免疫類檢測結果

3 結論

試驗采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對通便類、減肥類、清咽類、緩解體力疲勞/增強免疫類、降血糖/降血壓類、促進消化類共計6類131批次保健食品中的15種農(nóng)藥殘留進行檢測。具體過程：片劑經(jīng)乙腈-乙酸提取、膠囊劑經(jīng)乙腈提取、凈化后經(jīng)超高效液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜儀定性，外標法定量，通過方法驗證，符合植物源保健品中的農(nóng)藥殘留檢測標準。從檢測結果來看，植物源保健品中普遍存在農(nóng)藥殘留情況，有119批次檢出農(nóng)藥殘留，檢出率達90.8%。有64批次檢出2種及以上的農(nóng)藥殘留，其中：有3批次檢出5種農(nóng)藥殘留；有4批次檢出4種農(nóng)藥殘留；有17批次檢出3種農(nóng)藥殘留；40批次檢出2種農(nóng)藥殘留，降血糖、降血壓類檢出的農(nóng)藥殘留種類最多。多菌靈（3.22 mg/kg）、甲基硫菌靈（0.624 mg/kg）、霜霉威（0.459 mg/kg）檢出較高的殘留量，其他含量較低。

該試驗質(zhì)譜掃描采用MRM掃描模式，回收率、精確度均良好，可顯著提高靈敏度，實現(xiàn)多種物質(zhì)同時測定，適合植物源保健品中農(nóng)藥殘留的篩查和確證。該方法操作簡單、檢測速度快，適用于大批量樣品檢測，可為后續(xù)各類別植物源保健品農(nóng)藥殘留的檢測提供方法依據(jù)，為植物源保健食品的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。