枸杞黃酮的提取及其促進(jìn)傷口愈合潛力的探究

翟志毫，李長(zhǎng)恩，趙中楠，王先柱，王譯澤，王穎*

新疆大學(xué)紡織與服裝學(xué)院（烏魯木齊 830017）

皮膚作為人體最大的器官，具有許多重要的功能，如感知環(huán)境、調(diào)節(jié)體溫、提供被動(dòng)和主動(dòng)防御等[1-2]。然而，當(dāng)皮膚損傷程度超過(guò)其自身修復(fù)能力時(shí)，通常需要借助外源干預(yù)，如包扎、貼敷特效藥等方式促進(jìn)傷口愈合。傷口的愈合過(guò)程主要包括凝血、炎癥、增殖和重塑4個(gè)階段[3]，愈合過(guò)程中任何階段的失調(diào)都有可能延緩傷口愈合，使傷口惡化，甚至變?yōu)槁詡冢黾踊颊咄纯啵⑹购笃诎l(fā)病率和治療成本不斷提高[4]。研究發(fā)現(xiàn)，全球1%～2%的人正經(jīng)受慢性傷口的折磨，每年治療這類傷口的花費(fèi)超過(guò)250億美元[5-6]。因此，尋找并開(kāi)發(fā)促進(jìn)傷口促愈合的藥物至關(guān)重要。

近年來(lái)，天然藥物的研究與開(kāi)發(fā)受到國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注。長(zhǎng)期以來(lái)，枸杞作為傳統(tǒng)的藥物和功能性食材，被廣泛種植于青海、寧夏、新疆等地區(qū)[7]。大量研究表明枸杞中富含黃酮類、酰胺、生物堿、蒽醌等多種活性成分[8-10]，其中的黃酮類化合物具有促進(jìn)傷口愈合的活性，并且可以在傷口涵蓋愈合的4個(gè)階段均發(fā)揮作用，如增加膠原蛋白沉積、抵抗氧化應(yīng)激的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子、提高上皮化率和傷口收縮率、促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成[11-15]。此外Wang等[16]的研究表明，枸杞提取物還能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖和神經(jīng)元分化。因此，枸杞提取物在治療皮膚損傷等方面具有很大潛力。然而，國(guó)內(nèi)對(duì)枸杞提取物的研究主要集中于地區(qū)性黃酮含量差異的比較研究、提取工藝的優(yōu)化、黃酮的分離及純化等方面[17-19]，對(duì)于枸杞提取物作為潛在醫(yī)用敷料負(fù)載活性物質(zhì)的研究還較少。

因此，試驗(yàn)采用乙醇等溶劑對(duì)新疆精河縣紅果枸杞中的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行熱回流提取。通過(guò)DPPH自由基清除試驗(yàn)、抗菌試驗(yàn)評(píng)價(jià)枸杞提取物的體外抗氧化和抑菌性能，并通過(guò)小鼠成纖維細(xì)胞（L929）分析枸杞提取物的體外細(xì)胞毒性，以期為枸杞作為天然藥用植物資源在傷口愈合等生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅果枸杞（購(gòu)自中國(guó)新疆精河縣）；無(wú)水乙醇、石油醚、氯化鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蘆丁、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）、抗壞血酸（VC，AR，上海源葉生物技術(shù)有限公司）；大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）：南通凱恒生物技術(shù)有限公司；4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，北京索萊寶科技有限公司）；碘化丙啶（PI，北京索萊寶科技有限公司）；CCK-8試劑盒、小鼠成纖維細(xì)胞（L929）：武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枸杞黃酮提取單因素試驗(yàn)

利用單因素試驗(yàn)制備枸杞提取物。將清潔干燥后的枸杞粉碎并過(guò)0.425 mm孔徑（40目）篩。稱取50 g枸杞粉末，按照不同料液比（1∶7，1∶8，1∶9和1∶10 g/mL）浸泡于乙醇溶液（60%，70%，80%和90%）中，分別于50，60，70和80 ℃浸泡50，70，90和110 min。重復(fù)浸泡3次后，收集浸泡液并過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得枸杞提取物浸膏。

1.2.2 枸杞黃酮含量的測(cè)定

制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定枸杞中的黃酮含量[20]。擬合成線性方程：y=9.114 29x+0.007 14（R2=0.993 86），根據(jù)式（1）計(jì)算枸杞黃酮含量。

W=（V×N×C）/m（1）式中：W為枸杞黃酮含量，mg/g；V為測(cè)試吸光度溶液的定容體積，mL；N為醇提物溶液總體積與測(cè)吸光度部分體積之比；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到定容液的蘆丁溶液濃度，mg/mL；m為所用粉末總質(zhì)量，g。

1.2.3 枸杞提取物的抗氧化性能測(cè)試

制備0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。分別取2 mL不同濃度的枸杞溶液（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mg/mL），與2 mL DPPH溶液混合，避光保存30 min。以相同濃度的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，在517 nm處測(cè)量各組的吸光度。DPPH自由基清除率SR（%）按式（2）計(jì)算。

式中：Ai為待測(cè)液加入2 mL DPPH后，517 nm處的吸光度；Aj為待測(cè)液加入2 mL無(wú)水乙醇后，517 nm處的吸光度；Ac為DPPH溶液和無(wú)水乙醇的混合液在517 nm的吸光度。

1.2.4 枸杞提取物的抑菌性能測(cè)試

利用凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)枸杞提取物對(duì)E.coli和S.aureus的抑菌活性。分別取100 μL菌液（106～108CFU/mL）涂布于平板上。將浸泡過(guò)不同濃度的枸杞提取物的濾紙片（d=8 mm）放置于平皿中，于37 ℃培養(yǎng)16～24 h后測(cè)量濾紙片的抑菌圈直徑。

1.2.5 熒光染色法探究枸杞提取物對(duì)菌膜的作用機(jī)制

利用熒光染色法初步探究枸杞提取物的抑菌機(jī)制。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli和S.aureus分別與枸杞提取物（1 g/mL）于37 ℃孵育12 h。PBS洗滌菌體后，加入100 μL的DAPI和PI混合液（35 μg/mL），避光染色15 min。利用PBS洗滌菌體，去除多余染料后于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)菌。

1.2.6 SEM觀察枸杞提取物對(duì)菌體形態(tài)影響

利用SEM觀察細(xì)菌與枸杞提取物孵育后的形態(tài)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli和S.aureus分別與枸杞提取物（1 g/mL）于37 ℃孵育12 h。PBS洗滌菌體后，加入2.5%戊二醛溶液于4 ℃固定過(guò)夜。利用梯度濃度的乙醇脫水，每次脫水時(shí)間15 min。利用SEM觀察細(xì)菌形貌。

1.2.7 枸杞提取物的細(xì)胞毒性測(cè)試

利用CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)枸杞提取物對(duì)L929小鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性。將L929細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，取100 μL接種于96孔板中，分別加入不同濃度的枸杞提取物溶液，使其終濃度分別為2.5%，5.0%，7.5%和10.0%，培養(yǎng)24和48 h。每孔添加10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，于450 nm測(cè)量吸光度。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用Origin 2022b和Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

枸杞中的黃酮類化合物是抑菌、抗氧化的主要成分，為提高枸杞黃酮的提取效率，利用單因素試驗(yàn)檢測(cè)提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比以及浸泡時(shí)間對(duì)提取物中黃酮含量的影響。如圖1（A）所示，黃酮含量隨水浴溫度的提高而呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)。溫度70 ℃時(shí)黃酮含量達(dá)到最大，為15.13 mg/g，這可能是由于黃酮類化合物在較高溫度下的溶解度增加，但溫度過(guò)高黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被破壞。因此，提取溫度在70 ℃較為適宜。

植物中有效成分的提取率也與溶劑有關(guān)，試驗(yàn)利用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇（圖1B）提取枸杞中的黃酮，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)，提取物中黃酮含量最高，為15.52 mg/g。

此外，檢測(cè)不同料液比（圖1C）對(duì)提取物中黃酮含量的影響發(fā)現(xiàn)，料液比從1∶7（g/mL）增加到1∶8（g/mL）時(shí)黃酮含量增加，而繼續(xù)增加料液比，提取物中黃酮含量變化不明顯，因此制備枸杞提取物的最佳料液比為1∶8（g/mL）。檢測(cè)不同提取時(shí)間（圖1D）對(duì)枸杞提取物中黃酮含量的影響。結(jié)果顯示，黃酮含量隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)，提取時(shí)間90 min時(shí)，枸杞提取物中的黃酮含量最高，因此提取時(shí)間設(shè)定為90 min。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定，制備枸杞提取物的最佳條件是水浴溫度70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶8（g/mL）、提取時(shí)間90 min。在此條件下獲得的枸杞提取物中的黃酮含量為15.52 mg/g。

2.2 提取物抗氧化活性分析

反復(fù)發(fā)作的炎癥，會(huì)延遲傷口的愈合，而炎癥與自由基有關(guān)，清除過(guò)量的自由基可以減少炎癥的發(fā)生，促進(jìn)傷口愈合[21]。因此，通過(guò)DPPD清除法評(píng)價(jià)枸杞提取物的體外抗氧化活性。如圖2所示，枸杞提取物濃度0.5 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為22.97%，且與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系，最高可達(dá)81.4%，接近同等濃度下VC溶液（85.59%）。枸杞提取物良好的抗氧化活性主要來(lái)源于枸杞中的黃酮類化合物，此外提取物中還含有大量多糖、生物堿等活性物質(zhì)，對(duì)DPPH自由基也存在不同程度的清除作用[22-23]。

圖2 枸杞提取物的抗氧化活性

2.3 提取物的抑菌性能分析

細(xì)菌感染是延遲傷口愈合的另一個(gè)主要原因，因此通過(guò)凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)評(píng)價(jià)枸杞提取物的體外抑菌活性。各濃度下的抑菌效果如圖3所示。枸杞提取物濃度1 g/mL時(shí)對(duì)E.coli和S.aureus的抑菌圈直徑分別為11.0和11.5 mm，具有較好的抑菌效果。這可能是由于枸杞提取物中含有大量的黃酮類化合物，而這類化合物能夠破壞細(xì)菌膜的結(jié)構(gòu)并抑制核酸合成，從而達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用[24]。但是隨著枸杞提取物濃度的降低，抑菌圈逐漸減小，枸杞提取物的濃度低于0.2 g/mL與0.1 g/mL時(shí)，分別對(duì)E.coli和S.aureus無(wú)抑菌性。可能是因?yàn)榈蜐舛鹊奶崛∥镂茨軐?duì)細(xì)菌膜造成有效破壞，從而無(wú)法抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

圖3 枸杞提取物抑菌性能

2.4 熒光染色法檢探究枸杞提取物對(duì)菌膜的作用機(jī)制

為分析枸杞提取物的抑菌機(jī)制，利用DAPI和PI這2種熒光染料對(duì)與枸杞提取物共孵育后的細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性進(jìn)行檢測(cè)[25]。如圖4所示：由于DAPI可以穿透細(xì)菌細(xì)胞膜，因此所有的細(xì)菌在熒光顯微鏡下均顯示藍(lán)色；在菌體細(xì)胞膜完整的情況下，PI染料卻無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，所以在熒光顯微鏡下觀察不到熒光；與枸杞提取物共孵育后的細(xì)菌在熒光顯微鏡下可看到明顯的紅色，說(shuō)明枸杞提取物可能是通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性從而具有抑菌性能。

圖4 細(xì)菌熒光圖

2.5 SEM觀察枸杞提取物對(duì)菌體形態(tài)影響

利用SEM觀察枸杞提取物對(duì)菌體形貌的改變。如圖5所示，正常的菌體E.coli和S.aureus具有清晰的輪廓和完整的形態(tài)，且細(xì)菌表面光滑。而與枸杞提取物共孵育的細(xì)菌，菌體出現(xiàn)凹坑和破裂，甚至細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄的現(xiàn)象，細(xì)胞無(wú)法保持正常的細(xì)胞形態(tài)。因此，可以確定枸杞提取物能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，從而殺死細(xì)菌。

圖5 細(xì)菌SEM圖

2.6 枸杞提取物的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

理想的傷口敷料不僅需要具有一定的抑菌、抗氧化能力，還應(yīng)該能夠促進(jìn)傷口愈合。因此，用不同濃度（2.5%，5.0%，7.5%和10.0%）的枸杞提取物與小鼠成纖維細(xì)胞（L929細(xì)胞）共培養(yǎng)，并在24和48 h檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果如圖6所示。在24和48 h所有試驗(yàn)組的吸光度均大于空白對(duì)照組，根據(jù)細(xì)胞增殖率公式，按式（3）計(jì)算，得出各組的細(xì)胞增殖率均大100%[26]。因此，可以判定各試驗(yàn)組對(duì)L929細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，并在一定程度促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此，枸杞提取物可以作為一種促進(jìn)傷口愈合的潛在生物活性物質(zhì)。

圖6 枸杞黃酮提取物對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性

RGR=試驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100% （3）

3 結(jié)論

由于富含黃酮等多種生物活性物質(zhì)及其廣泛的藥理作用，新疆枸杞在皮膚傷口愈合方面具有較大應(yīng)用潛力。以新疆枸杞為研究對(duì)象，通過(guò)單因素法、DPPH法、抑菌試驗(yàn)、CCK-8法、熒光染色試驗(yàn)等方法進(jìn)行枸杞提取工藝的分析及其傷口愈合活性的評(píng)價(jià)，以探討負(fù)載枸杞提取物的傷口敷料用于治療皮膚傷口愈合的潛力。

結(jié)果表明：在水浴溫度70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶8（g/mL）、靜置時(shí)間90 min的提取條件下，所提取的枸杞黃酮含量最高，為15.52 mg/g，而且提取工藝簡(jiǎn)單，成本低、效率高；所提取的活性物質(zhì)可有效發(fā)揮抑菌、抗氧化等作用，且有濃度效應(yīng)，對(duì)典型菌種如大腸桿菌、金黃色葡萄球的最低抑菌濃度分別為0.2和0.1 g/mL，而且濃度2.5 mg/mL時(shí)其DPPH自由基清除力與同濃度的抗壞血酸相當(dāng)；枸杞提取物可通過(guò)與細(xì)菌細(xì)胞膜相結(jié)合并破壞膜結(jié)構(gòu)的機(jī)制使細(xì)菌失活，從而達(dá)到抑菌、殺菌的效果。此外，枸杞提取物無(wú)細(xì)胞毒性，并能促進(jìn)L929細(xì)胞增殖，從而有利于皮膚傷口愈合。因此，枸杞提取物具有的生物活性特征，可作為治療皮膚傷口材料的有效負(fù)載物。