膠體磨復合酶法浸提香菇多糖的工藝優化

唐坤，龍歡，尚校蘭

1.廊坊師范學院生命科學學院（廊坊 065000）；2.河北省食藥用菌資源高值利用技術創新中心（廊坊 065000）；3.廊坊市食品營養與安全重點實驗室（廊坊 065000）

香菇（Lentinus edodes）是世界上產量第二大的食用菌[1]，我國也是當今世界上最大的香菇生產國和消費國[2]。香菇多糖（lentinan，LNT）主要由香菇中的β-1, 3-葡聚糖和其他多糖類物質D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖等共同組成[3]，具有免疫調節[4-5]、降血脂[6]、抑制腫瘤細胞增殖[7]、抗氧化[8]和降糖[9]等多種藥理活性，因此在食品、保健品和藥品方向均有廣泛應用[10]。

LNT的提取方法有多種，可分為化學提取法（水、酸或堿為溶劑）、物理提取法（微波或超聲法）和生物提取法（酶解或發酵）[11-12]，而2種或2種以上提取方法聯合應用的復合法不僅比單一提取方法節約時間，還能提高產率，效果也優于傳統提取方法[3]，因此以水為基礎溶劑，運用膠體磨的超微濕粉碎原理[13]，采用膠體磨與復合酶法聯用的方法浸提香菇多糖，經單因素試驗和正交試驗優化后工藝所得LNT提取率顯著高于同法單一的提取方法（水煎法、超聲波浸提法、膠體磨浸提法）。該法節能環保，提取條件溫和，提取效能高，且利用該法提取LNT的研究尚未見諸報道，因此可為LNT浸取技術的優化提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干香菇（河北昊藝食用菌股份有限公司）；纖維素酶、果膠酶（河南萬邦化工科技有限公司）；幾丁質酶（常茂生物化學工程股份有限公司）。材料均為食品級。

D-無水葡萄糖（批號110833-201908，含量標示99.8%，中國食品藥品檢定研究院）；苯酚、濃硫酸、無水乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸（試劑均為分析純）；5%苯酚溶液（自配）。

1.2 儀器與設備

SQP-電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；722型分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；榮華HH-4數字恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；JA21002電子分析天平（北京京東世紀信息技術有限公司）；酸度計（上海越平科學儀器有限公司）；DHSI6-A多功能紅外水分測定儀（上海精科天美科學儀器有限公司）；膠體磨（無錫輕大食品裝備有限公司）；ZXRD-A7140恒溫鼓風干燥箱（上海圣科儀器有限公司）；BJ-800A多功能粉碎機（德清拜杰電器有限公司）；KQ-300DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；金怡牌TDZ4-WS電動離心機（金壇市醫療儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 香菇多糖的提取與工藝流程

取凈制后的干香菇，低溫烘烤至含水量6%以下，粉碎，過0.180 mm孔徑（80目）篩。取5.00 g香菇細粉，在膠體磨中加一定比例水進行充分研磨，所得漿液調至pH 5.4后加入一定量的復合酶（W纖維素酶∶W果膠酶∶W幾丁質酶=1∶1∶1），在指定溫度下酶解數分鐘后取出，酶解液置于90 ℃水浴中10 min滅酶，在80℃恒溫水浴攪拌浸提2次，每次1.0 h，過濾，合并2次濾液，濾液濃縮至15 mL，加3倍乙醇醇沉，在4 ℃靜置24 h，按4 000 r/min離心15 min棄上清液，不溶物干燥，稱重即得。工藝流程：取凈香菇→干燥→粉碎→過篩→得香菇細粉→加水研磨（A）→得香菇漿液→調pH→復合酶解（B、C、D）→得香菇酶解液→熱提→過濾→濃縮→醇沉→離心→得香菇粗多糖。

其中，影響多糖提取率的4個主要因素分別為料液比（A）、復合酶添加量（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）。

1.3.2 香菇多糖的提取率計算[14]

1.3.2.1 葡萄糖溶液標準曲線的制備

從已配制的葡萄糖標準溶液（100 μg/mL）中分別精密吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL于具塞試管中，加蒸餾水補至1.0 mL，向每個管中依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液和5.0 mL H2SO4，放置10 min，在沸水浴中反應2 min，冷卻，在波長490 nm處，以空白溶液為參比，測各標準液的吸光度。再以葡聚糖質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2.2 樣品的含量測定

將干燥后所得香菇多糖加15 mL水稀釋，從中取1 mL，加水稀釋至1 000 mL，從中取2 mL，向管中依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液和5.0 mL H2SO4，放置10 min，在沸水浴中反應2 min，冷卻，在波長490 nm處，以空白溶液為參比，測樣品的吸光度。試驗均3次平行測定。

1.3.2.3 香菇多糖提取率的計算[15]

香菇多糖提取率按式（1）計算。

式中：W為香菇多糖提取率，%；Cs為被測樣品溶液的葡萄糖質量濃度，μg/mL；D為樣品溶液的稀釋倍數；V為被測樣品溶液體積，mL；m為香菇取樣量，g；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數。

1.3.3 單因素試驗設計

提取中料液比（A）、復合酶添加量（B）、酶解時間（C）和酶解溫度（D）是影響香菇多糖提取率的主要因素，因此將依據1.3.1的步驟進行多糖提取的單因素試驗。

1.3.3.1 料液比

稱取5.00 g干燥后的香菇細粉，在復合酶添加量3%、酶解時間50 min、酶解溫度60 ℃條件下，考察不同料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）對香菇多糖提取率的影響。

1.3.3.2 復合酶添加量

稱取5.00 g干燥后的香菇細粉，在料液比1∶40（g/mL）、酶解時間50 min、酶解溫度60 ℃條件下，考察不同復合酶添加量（1.0%，2.0%，2.5%，3.0%和3.5%）對香菇多糖提取率的影響。

1.3.3.3 酶解時間

稱取5.00 g干燥后的香菇細粉，在料液比1∶40（g/mL）、復合酶添加量2.5%、酶解溫度60 ℃條件下，考察不同酶解時間（30，40，50，60和70 min）對香菇多糖提取率的影響。

1.3.3.4 酶解溫度

稱取5.00 g干燥后的香菇細粉，在料液比1∶40（g/mL）、復合酶添加量2.5%、酶解時間30 min條件下，考察不同酶解溫度（30，40，50，60和70 ℃）對香菇多糖提取率的影響。

1.3.4 正交試驗設計

依據單因素試驗的試驗結果，從料液比、復合酶添加量、酶解時間和酶解溫度4個因素中，確定較適宜的3個水平，采用L9(34)進行正交試驗，以香菇多糖提取率為考察指標，優化香菇提取工藝，確定最佳工藝條件。正交試驗因素與水平設計見表1。

1.3.5 提取方法的比較

稱取5.0 g香菇，將優化后的膠體磨復合酶法工藝與傳統水煎法、粉碎水煎法、超聲波浸提法、膠體磨浸提法5種提取技術進行比較，觀察不同提取方法對香菇多糖提取率的影響，不同提取方法見表2，過濾，合并2次濾液，濾液濃縮至15 mL，加3倍乙醇醇沉，在4 ℃靜置24 h，按4 000 r/min離心15 min棄上清液，不溶物干燥，稱重即得。香菇多糖提取率的計算方法同 “1.3.2.2”項下“樣品的含量測定”所述。

表2 香菇不同提取方法的比較

1.3.6 數據分析

試驗數據計算平均值，表示為平均值±標準差。數據用SPSS 20軟件進行方差分析，Dunnett法進行多組與對照的定量比較，P＜0.05時有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖溶液的標準曲線

由圖1可見，葡萄糖溶液標準曲線的線性回歸方程為Y=0.036X+0.006 9，r=0.999 7，表明葡萄糖質量濃度在2.857～14.286 μg/mL之間呈良好線性關系。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 料液比對香菇多糖提取率的影響

由圖2可知：料液比在1∶15～1∶40（g/mL）時，香菇多糖提取率隨香菇濃度的減少反而增大，到1∶40（g/mL）時多糖提取率最高。但料液比在1∶50（g/mL）時，多糖提取率反而略有減少。該結果顯示隨著提取香菇的加水量增加，香菇溶質向外的擴散速度不斷擴大，因此提取率增大[16]。但當擴散速率達平衡時，原料與酶催化反應的速率也會逐漸減弱，進而溶質擴散速率降低，多糖提取率逐漸減少。因此，單因素條件下料液比以1∶30～1∶50（g/mL）為宜，1∶40（g/mL）時提取效果最好。

圖2 料液比對香菇多糖提取率的影響

2.3 酶添加量對香菇多糖提取率的影響

由圖3可知：復合酶添加量在1%～2.5%時，香菇多糖提取率隨酶量增加而增大，復合酶添加量2.5%時多糖提取率最高，隨著酶量繼續加大，提取率反而呈下降趨勢。因此，單因素條件下酶添加量以2.0%～3.0%為宜，但2.5%時提取效果最好。

圖3 酶添加量對香菇多糖提取率的影響

2.4 酶解時間對香菇多糖提取率的影響

香菇提取時酶解時間考察范圍在30～70 min之間。由圖4可知：在30～60 min范圍內其多糖提取率均高于11%，酶解時間超過60 min后，提取率反而急速下降，因此，單因素條件下酶解時間以30～50 min為宜，但30 min時提取效果最好。

圖4 酶解時間對香菇多糖提取率的影響

2.5 酶解溫度對香菇多糖提取率的影響

香菇提取時酶解溫度考察范圍在30～70 ℃之間。由圖5可知：在30～60 ℃范圍內，酶解效率均大于20%，但酶解溫度超過60 ℃，其多糖提取率隨溫度增高反而急劇下降，因此單因素條件下酶解溫度在30～50 ℃為宜，40 ℃時提取效果最好。

圖5 酶解溫度對香菇多糖提取率的影響

2.6 正交試驗

正交試驗因素與水平設計見表1，正交試驗結果見表3。影響香菇多糖提取率的因素為料液比＞酶解溫度＞酶添加量＞酶解時間。最佳工藝組合為A2B2C3D2，即料液比1∶40（g/mL）、酶添加量2.5%、酶解溫度50 ℃、酶解時間40 min。對該組合進行優化驗證，其中香菇提取量擴大為原試驗量的10倍，平行試驗3次，多糖提取率平均值為21.59%，SRSD為1.41%，結果顯示該法重現性好，工藝條件穩定。

表3 正交試驗結果

2.7 提取方法的對比性驗證結果

如圖6所示，比較不同提取方法對香菇多糖提取率的影響，膠體磨復合酶法浸提香菇多糖提取率為21.24%，提取效果依次為膠體磨復合酶法＞膠體磨浸提法＞超聲波浸提法＞粉碎水煎法＞傳統水煎法。結果經SPSS 20軟件Dunnett雙側檢驗（A組為對照）的方差分析，膠體磨復合酶法的提取效率是傳統水煎法的3.3倍（P＜0.05）、粉碎水煎法的1.9倍（P＜0.05）、超聲波浸提法的1.5倍（P＜0.05）、膠體磨浸提法的1.3倍（P＜0.05），顯示膠體磨復合酶提取方法對香菇多糖的提取效率與其他提取方法相比具有非常顯著性差異（圖6）。

圖6 不同提取方法對香菇多糖提取率的影響

3 結論與展望

膠體磨復合酶法經單因素試驗、正交試驗、驗證試驗及與各種常見提取方法的比較，結果得出膠體磨復合酶法提取香菇多糖的最佳工藝參數為料液比1∶40（g/mL）、酶添加量2.5%、酶解溫度50 ℃、酶解時間40 min。該條件下所得到的香菇多糖提取率顯著高于水提法、超聲法和膠體磨法。

LNT的溶劑提取法中，熱水提取法存在長時間高溫加熱、煎煮耗能高、提取雜質多、提取效率低的問題；酸堿提取法又極易破壞多糖的糖苷鍵和生物活性；超聲波提取法利用超生波的空化效應[14]、微波提取法利用微波的熱效應盡管均能提高LNT的提取效率[3,17]，但二者由于缺乏配套的生產設備而不易轉化到生產實踐中。因此以水作溶媒，利用膠體磨的超微濕粉碎原理，通過強烈的剪切、摩擦、沖擊、研磨等作用力，破壞香菇細胞壁的致密結構，將香菇粉研磨成顆粒非常細微的穩定懸浮液[13,18]；加入生物復合酶（W纖維素酶∶W果膠酶∶W幾丁質酶=1∶1∶1）水解纖維素和糖蛋白，促進胞內溶質成分克服細胞壁及細胞間質的阻力加速溶出擴散[19]，以此提高熱水浸提法提取香菇粗多糖的效率，因此該法聯合運用3種提取方法復合提取香菇多糖，優化后的工藝與其他提取方法相比較，提取效率提高1.3～3.3倍（P＜0.05），因此該方法為香菇多糖的產業化提取工藝的深化提供參考。

我國是香菇生產大國，LNT具有豐富的生物活性和多種應用方向[20-21]，且提取制備工藝對LNT化學結構影響較大，因此安全性強、浸提效率高，且能有效節能減排的LNT提取制備技術才最具有生命力和延展性，也是未來采用新技術、新工藝提取LNT的研究方向。