正交試驗優化齒瓣石斛多糖提取工藝

劉洪均，包譽，胡江苗，何桃斌*，楊青松*

1.云南民族大學民族藥資源化學國家民族事務委員會-教育部重點實驗室（昆明 650504）；2.云南民族大學民族醫藥學院（昆明 650504）；3.中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室（昆明 650201）

石斛屬（Dendrobium）是蘭科（Orchidaceae）植物中第一大屬，全球有約1 500種，廣泛分布在亞洲、歐洲、大洋洲等地區[1]。在我國，已報道的石斛屬植物超過80種[2]。石斛為名貴中藥材，始載于《神農本草經》，主治熱病傷津、胃痛干嘔、肺燥干咳等癥[3]。藥理研究表明其具有抗衰老[4]、抗腫瘤[5]、免疫調節[6]、擴張血管[7]、降低血糖[8]等多種活性。齒瓣石斛（DendrobiumdevonianumPaxt），又稱紫皮石斛、紫皮蘭、水打棒、黃草等，在我國主要分布于云南、廣西、貴州、西藏南部等地，具有滋陰益胃、生津止渴之功效[9-10]。云南省保山市龍陵縣是齒瓣石斛傳統分布區，也是齒瓣石斛主要種植區，初步統計全縣種植齒瓣石斛3萬余畝（1畝≈666.67 m2），有著“紫皮石斛之鄉”的美譽。《云南省食品安全地方標準-紫皮石斛》發布，并于2018年2月19日正式實施。自此，齒瓣石斛除了傳統加工楓斗之外，還可以作為地方特色食品。

齒瓣石斛多糖含量高，平均在30%左右[11]，特色食品加工過程中，為滿足不同產品需求，對多糖得率、黏度、透明度等有不同要求。為探討合理的齒瓣石斛多糖的提取方法，提升齒瓣石斛加工工藝，選取云南產齒瓣石斛為原料，通過設計正交試驗，測定其多糖的提取率，找到較為優化的多糖提取工藝，為日后對齒瓣石斛的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

齒瓣石斛（云南省龍陵縣龍陵石斛研究所）；葡萄糖（XK13-201-00115，天津市風船化學試劑科技有限公司）；蒽酮（Solarbio）；硫酸（四川西隴化工有限公司），均為分析純。

1.2 儀器與設備

LGJ-1冷凍干燥機（北京亞泰科隆儀器有限公司）；SK-18TC超聲波清洗器（上海科儀）；DL-6M離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；FST-111-80超純水機（上海富待特儀器設備有限公司）；DK-8AD電熱恒溫水浴槽（上海一恒科技有限公司）；-80 ℃超低溫冰箱（中國海爾集團）；FDV超微粉碎機（北京環亞天元機械技術有限公司）；SI-114電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；移液器（大龍儀器）；多功能酶標儀（美國Molecular Devices Flexstation 3）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗材料預處理

試驗材料所用的齒瓣石斛采自云南龍陵。摘取當年生新鮮齒瓣石斛，洗凈后去葉，只留其莖，放入干燥箱中烘干，取干燥的石斛樣品，放入超微粉碎機中粉碎待用。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的制備

分別取0.05，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80和1.00 mL的0.1 g/L葡萄糖溶液于標記好的小離心管中，用蒸餾水補到1.0 mL，此為標準樣品。分別加入4.00 mL蒽酮試劑，迅速放到冰水浴中冷卻，各管加完后一起放入沸水浴中，在沸水中沸水浴10 min（自水沸起記時），而后用自來水冷卻。室溫放置10 min左右。另以1.0 mL蒸餾水同上平行操作，用移液槍分別移200 μL到全透明微孔板內，每個樣品做3個平行，將加好樣的全透明微孔板放入微孔板檢測系統中，在波長620 nm處測其吸光度。

1.3.3 齒瓣石斛多糖含量的測定

按線性回歸方程計算齒瓣石斛多糖含量。

1.3.4 齒瓣石斛多糖提取率的計算試驗是以提取齒瓣石斛多糖的提取率作為評價指標，齒瓣石斛多糖提取率根據式（1）計算。

式中：ω為多糖提取率，%；a為糖含量，μg/mL；b為凍干試驗量，g；c為凍干后質量，g；d為石斛粉質量，g。

1.3.5 正交試驗設計

以提取方式、料液比、提取溫度、提取時間、提取次數5個因素，根據不同條件，針對提取方式設置2個水平，料液比和提取溫度設置4個水平，提取時間和提取次數設置3個水平，應用正交表生成軟件進行試驗設計（見表1）。

表1 試驗因素及水平

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

由吸光度（x）與濃度（y）進行線性回歸分析，如圖1所示。其回歸方程為y=0.296 4x+0.001 6，相關系數R2=0.999 4，即葡萄糖標準品溶液的濃度與吸光度有良好的線性關系，因此可用此標準曲線計算糖濃度。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 齒瓣石斛多糖含量計算

用樣品在波長620 nm處的吸光度帶入公式計算得出各個樣品的糖含量，如表2所示。

表2 齒瓣石斛不同樣品吸光度

接表2

2.3 齒瓣石斛多糖提取率分析

由表2可知，編號為48的樣品多糖含量最高，但是，試驗是以提取齒辦石斛多糖的提取率作為評價指標，從而判斷齒瓣石斛多糖提取的最佳提取工藝，所以經上述試驗所得數據計算多糖提取率，按式（1）計算，具體計算結果如表3所示。

表3 齒瓣石斛不同樣品多糖提取率

接表3

2.4 正交試驗結果

根據因素水平表進行正交試驗，試驗結果如表4所示。料液比、提取方式、提取溫度、提取次數、提取時間均對樣品提取多糖的含量有顯著影響，影響程度依次為D＞E＞B＞C＞A，即提取時間＞提取次數＞液料比＞提取溫度＞提取方式。通過極差分析得到的理論最優組合A2B3C4D1E1，試驗驗證其多糖提取率（27.197%）不如正交試驗最優結果A1B3C4D2E2（提取率30.664%），即超聲提取、料液比1∶40（g/mL）、提取溫度100 ℃、時間4 h、提取次數2次。由表5方差分析結果可知，通過在0.05顯著水平上的檢驗，提取時間和提取次數2種因素對齒瓣石斛多糖提取得率有顯著影響。

表4 正交試驗結果

表5 方差分析

以最佳提取條件進行3次平行試驗，得到齒瓣石斛多糖提取得率30.66%。說明該提取條件具有較好的合理性和可靠性，適用于齒瓣石斛多糖的提取。

3 結論與討論

由正交試驗分析可知：提取方式、料液比、提取溫度、提取次數、提取時間均對樣品提取多糖的含量有顯著影響，其因素主次順序為D＞E＞B＞C＞A，即最重要的因素為提取時間，其次是提取次數，再次是料液比、提取溫度和提取方式。最終得到的齒辦石斛多糖的最佳提取條件為超聲提取、料液比1∶40（g/mL）、提取溫度100 ℃、時間4 h、提取次數2次，提取率為30.66%。在此工藝條件下，所得齒瓣石斛多糖提取率較高，具有省時、高效、節能等優點，可為齒瓣石斛深加工提供新的工藝方案。

根據結果得知，提取時間和提取次數對齒瓣石斛多糖提取率有顯著的影響。就提取時間而言，提取的時間越長，多糖溶出越多。王洪云等[12]研究也表明提取時間對齒瓣石斛多糖提取率影響最大。提取次數越多，提取效率也越高，因為每次提取都將更換新的溶劑，使得多糖溶出量也隨之增加。劉靜平等[13]在鐵皮石斛類原球莖多糖的提取純化工藝中同樣發現，提取次數對多糖的提取有極顯著的影響。秦令祥等[14]采用閃提法提取香菇多糖，結果表明提取次數對香菇多糖的提取率影響較大。石斛提取加工過程中，傳統熱水回流提取方案溶出率較高，但同時也存在提取時間長、成本高、雜質多、澄清度差等不足之處[15]。超聲提取法是利用超聲波對細胞進行空化作用，引起細胞的強烈振動，使有效成分加速溶解到溶劑中，具有綠色、高效的特征，從而更好、更快地對多糖進行提取[16-17]。超聲提取有利于多糖的迅速溶出和擴散，比回流提取更加省時、高效。孟繁磊等[18]對刺五加多糖的超聲提取工藝進行研究，采用超聲法提取刺五加多糖的平均提取率為10.87%。葉余原[19]采用超聲法提取鐵皮石斛多糖，在同樣的條件下，超聲法比水提法更加高效。孟良玉等[20]對枸杞多糖的超聲提取工藝中，同樣表明超聲提取法可有效提高多糖的得率。因此，該工藝可為齒瓣石斛多糖提取提供一個新方案，為今后的深入加工利用提供一些參考。