血清絲氨酸蛋白酶抑制劑A3在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及對(duì)患者預(yù)后的影響*

帥晉豪，王鵬，季昳馳

(眉山市人民醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科,四川 眉山 621000)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在全球發(fā)病率以每年3.1%的速度增長(zhǎng)，從1980年的64.1萬(wàn)例增加到2010年的160萬(wàn)例[1]。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布2020年女性患乳腺癌約226萬(wàn)例，其中死亡人數(shù)達(dá)68萬(wàn)[2]。乳腺癌的治療策略因分子亞型而異，目前已鑒定出LuminalA型、Luminal B型、HER2陽(yáng)性型和三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)4種亞型。TNBC的特征是雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子 2-受體不表達(dá)，約占所有乳腺癌的15%～20%。與其他亞型的乳腺癌相比，TNBC更具侵襲性的生物學(xué)特性，轉(zhuǎn)移較早、疾病進(jìn)展迅速、對(duì)現(xiàn)有療法的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間短，生存結(jié)果較差[3-4]。血清絲氨酸蛋白酶抑制劑A3(serum serpin A3，SERPINA3)是一種分泌型絲氨酸蛋白酶抑制劑，通過(guò)蛋白水解抑制幾種重要絲氨酸蛋白酶的生物活性，例如組織蛋白酶G和糜蛋白酶[4]，也是一種可被細(xì)胞因子刺激的急性期蛋白[5]。有報(bào)道顯示，SERPINA3在實(shí)體瘤中表達(dá)增加[6]，其高表達(dá)被認(rèn)為與結(jié)直腸癌[7]、肝細(xì)胞癌[8]和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[9]的發(fā)生有關(guān)。Zhang等[10]研究表明SERPINA3的過(guò)表達(dá)促進(jìn)TNBC腫瘤的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，但目前還沒(méi)有關(guān)于SERPINA3與TNBC臨床病理參數(shù)相關(guān)性的數(shù)據(jù)，亦未見(jiàn)SERPINA3影響TNBC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素的研究。本研究通過(guò)檢測(cè)TNBC腫瘤組織和癌旁組織中SERPINA3的表達(dá)，分析其在TNBC組織中的表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月—2019年5月診治的86例TNBC患者，按照SERPINA3在腫瘤組織中的表達(dá)情況將患者分為低表達(dá)組(免疫組化評(píng)分≤6分，n=35)和高表達(dá)組(免疫組化評(píng)分>6分，n=51)。納入標(biāo)準(zhǔn)：初次確診，術(shù)前未接受放化療等治療，行乳腺癌改良根治術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤患者，預(yù)計(jì)生存時(shí)間小于3個(gè)月，術(shù)后未遵醫(yī)囑行規(guī)范的治療。本研究經(jīng)患者知情同意。收集患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、絕經(jīng)、空腹血糖、甘油三酯、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和血肌酐等一般資料。

1.2 方法

1.2.1病理資料 收集患者腫瘤組織學(xué)分級(jí)、組織病理學(xué)分類、術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)、腫瘤直徑(≤2 cm、2～5 cm、≥5 cm)、區(qū)域淋巴結(jié)狀態(tài)和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移等病理資料。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)標(biāo)本 收集患者TNBC腫瘤組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織，采用中性甲醛固定、石蠟包埋并制備石蠟切片(厚度約4 μm)。

1.2.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織中SERPINA3的表達(dá) 各組石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化及枸櫞酸鈉液抗原修復(fù)一抗SERPINA3(1 ∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1 ∶400)室溫孵育30 min。DAB試劑染色3～5 min、復(fù)染1～3min、返藍(lán)1 min、中性樹(shù)膠封2，顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取4個(gè)高倍鏡觀察定位。細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒狀物質(zhì)沉積，即為SERPINA3的陽(yáng)性表達(dá)。由兩位病理科醫(yī)生在雙盲的情況下獨(dú)立閱片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×200)，染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)著色、淺黃色、棕黃色和棕褐色分別為0分、1分、2分和3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞比例0、<25%、25%～<50%和≥50%分別為0分、1分、2分和3分，SERPINA3的染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分≤6分為低表達(dá)組(n=35)，SERPINA3的染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分>6分為高表達(dá)組(n=51)。

1.2.4隨訪 術(shù)后門診定期隨訪，隨訪項(xiàng)目主要包括臨床體檢、乳腺彩超、乳腺X線、胸片或胸部CT、腹部超聲、骨掃描(腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移>4枚等高危因素的患者)、血常規(guī)、血生化、乳腺腫瘤標(biāo)志物、心肌標(biāo)志物及治療的依從性，評(píng)估患者手術(shù)、化療和放療的不良反應(yīng)及是否有伴隨疾病的發(fā)生。隨訪時(shí)間6～36個(gè)月，隨訪時(shí)間結(jié)束或患者死亡為隨訪終點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件分析。計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，行χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Kaplan- Meier分析法繪制SERPINA3高表達(dá)組和SERPINA3低表達(dá)組間生存曲線圖，并采用Log- rank檢驗(yàn)比較兩組間的生存率。Cox單因素和多因素回歸分析影響患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的危險(xiǎn)因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

兩組TNBC患者年齡、BMI、絕經(jīng)、空腹血糖、甘油三酯、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和血肌酐比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組TNBC患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general data between both groups

2.2 SERPINA3在TNBC組織中的表達(dá)

SERPINA3在TNBC癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為5.8%(5/86)，在TNBC癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為100.0%(86/86)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖1。

癌旁組織 癌組織圖1 SERPINA3在癌旁組織和癌組織中的表達(dá)(SP，×200)Fig.1 Expression of SERPINA3 in para-cancerous tissue and cancer tissue (SP,×200)

2.3 SERPINA3表達(dá)水平與TNBC患者臨床病理參數(shù)

SERPINA3高表達(dá)組患者腫瘤病理分級(jí)為Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)患者比例均高于SERPINA3低表達(dá)組，SERPINA3高表達(dá)組術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)患者比例高于SERPINA3低表達(dá)組，SERPINA3高表達(dá)組腫瘤直徑>5 cm患者比例高于SERPINA3低表達(dá)組，SERPINA3高表達(dá)組區(qū)域淋巴結(jié)陽(yáng)性患者比例高于SERPINA3低表達(dá)組，SERPINA3高表達(dá)組遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移患者比例高于SERPINA3低表達(dá)組。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 SERPINA3表達(dá)水平對(duì)TNBC患者臨床病理參數(shù)的影響[n(%)]Tab.2 Expression of SERPINA3 and its influence on clinic-pathological parameters in TNBC patients[n(%)]

2.4 SERPINA3表達(dá)水平與TNBC患者術(shù)后3年總生存率和無(wú)進(jìn)展生存率

根據(jù)隨訪結(jié)果計(jì)算患者的3年總生存率，SERPINA3高表達(dá)組患者術(shù)后3年生存率為58.8%，SERPINA3低表達(dá)組術(shù)后3年總生存率為82.9%，log-rank檢驗(yàn)顯示SERPINA3高表達(dá)組術(shù)后3年總生存率低于SERPINA3低表達(dá)組(log-rankχ2=5.706，P=0.017)。SERPINA3高表達(dá)組患者術(shù)后3年無(wú)進(jìn)展生存率為43.1%，SERPINA3低表達(dá)組術(shù)后3年無(wú)進(jìn)展生存率為71.4%，log-rank檢驗(yàn)顯示SERPINA3高表達(dá)組患者術(shù)后3年無(wú)進(jìn)展生存率低于SERPINA3低表達(dá)組(log-rankχ2=6.672，P=0.010)。見(jiàn)圖2。

圖2 SERPINA3表達(dá)水平對(duì)TNBC患者術(shù)后3年總生存率和無(wú)進(jìn)展生存率的影響Fig.2 Effects of SERPINA3 expression on postoperative 3-year overall survival rate and progression-free survival rate in TNBC patients

2.5 影響TNBC患者總生存期的單因素和多因素COX回歸分析

經(jīng)COX單因素回歸分析顯示，腫瘤組織學(xué)分級(jí)、術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)、腫瘤大小、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移及SERPINA3高表達(dá)是影響TNBC患者無(wú)進(jìn)展生存期的因素；將以上因素帶入多因素COX回歸模型中分析顯示，腫瘤組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)、術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)、腫瘤直徑≥5 cm、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移及SERPINA3高表達(dá)是影響總生存期的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3。

表3 影響TNBC患者總生存期的單因素和多因素COX回歸分析Tab.3 Uni-variate and multi-variate COX regression analysis of factors affecting overall survival in TNBC patients

2.6 影響TNBC患者無(wú)進(jìn)展生存期的單因素和多因素COX回歸分析

經(jīng)COX單因素回歸分析顯示，腫瘤組織學(xué)分級(jí)、術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)、腫瘤直徑、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移和SERPINA3高表達(dá)為影響無(wú)進(jìn)展生存期的因素，將以上因素帶入多因素COX回歸模型中分析顯示術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移和SERPINA3高表達(dá)為影響無(wú)進(jìn)展生存期的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 影響TNBC患者無(wú)進(jìn)展生存期的單因素及多因素COX回歸分析Tab.4 Uni-variate and multi-variate COX regression analysis of factors affecting progression-free survival

3 討論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中TNBC約占乳腺癌的15%，流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示TNBC發(fā)病年齡較輕，腫瘤侵襲性強(qiáng)，易于局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[10]。與其他乳腺癌亞型相比，TNBC患者的生存時(shí)間較短，5年內(nèi)死亡率為40%[11]。TNBC具有高度侵襲性，約46%的患者會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移后中位生存時(shí)間僅為13.3個(gè)月，術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)25%[12]。值得注意的是，TNBC患者惡性程度高、預(yù)后差、治療靶點(diǎn)有限，因此尋找TNBC患者新的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床價(jià)值。SERPINA3也稱為α-1-抗糜蛋白酶，是一種分子量為55～66 kDa的分泌型絲氨酸蛋白酶，可抑制幾種絲氨酸蛋白酶的活性[13]。以往研究表明，SERPINA3在胞質(zhì)分裂、增殖、凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[14-15]。此外，還有報(bào)道顯示SERPINA3參與多種免疫反應(yīng)，有望成為子宮內(nèi)膜癌的潛在免疫治療靶點(diǎn)[16-17]。Nimbalkar等[18]人發(fā)現(xiàn)SERPINA3有助于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)變。此外，Luo等[19]人通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)證明，高水平的 SERPINA3 信使 RNA與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)。以上研究均顯示SERPINA3參與惡性腫瘤的發(fā)展，可能子宮內(nèi)膜癌和膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后，但對(duì)TNBC患者的影響還不明確。

在本研究通過(guò)免疫組化檢測(cè)到TNBC組織中SERPINA3陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，推測(cè)SERPINA3可能參與TNBC的惡性進(jìn)展。通過(guò)分析TNBC組織中SERPINA3表達(dá)與TNBC病理特征的關(guān)系，結(jié)果表明SERPINA3高表達(dá)促進(jìn)TNBC向高級(jí)別腫瘤組織學(xué)分型進(jìn)展，促進(jìn)TNBC腫瘤的增長(zhǎng)、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及術(shù)后的復(fù)發(fā)。Yuan等[17]研究顯示，SERPINA3高表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性腫瘤相關(guān)，包括高級(jí)別的腫瘤和較短的生存時(shí)間。Zhang等[10]研究顯示，SERPINA3可以調(diào)節(jié)TNBC細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其陽(yáng)性表達(dá)增加TNBC細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，因此SERPINA3可能成為治療TNBC的有效靶點(diǎn)。Zhang等[10]研究進(jìn)一步證實(shí)了SERPINA3與TNBC的惡性侵襲相關(guān)。生存分析結(jié)果顯示，SERPINA3高表達(dá)組TNBC患者的3年總生存率和無(wú)進(jìn)展生存率均低于SERPINA3低表達(dá)組，說(shuō)明SERPINA3影響TNBC患者的預(yù)后。為了更進(jìn)一步了解SERPINA3是否為TNBC預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，Cox單因素和多因素回歸分析顯示SERPINA3高表達(dá)為TNBC 患者3年總生存率和無(wú)進(jìn)展生存率的危險(xiǎn)因素。Cao等[20]研究顯示高表達(dá)的SERPINA3與結(jié)腸癌的主要臨床病理特征密切相關(guān)，且沉默SERPINA3的表達(dá)可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，為治療結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移提供了一種有前景的治療策略。根據(jù)Zhang等[10]和Cao等[20]研究思路設(shè)想，沉默SERPINA3亦有望成為治療TNBC患者的有效靶點(diǎn)。

本研究?jī)H分析TNBC組織中SERPINA3的表達(dá)與患者臨床病理特征和預(yù)后的影響，但具體的作用機(jī)制并不明確。King等[21]研究表明，SERPINA3也是一種受細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的炎癥蛋白，對(duì)許多細(xì)胞因子非常重要，包括白細(xì)胞介素6和白細(xì)胞介素1，細(xì)胞因子失衡會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的高激活或低激活，導(dǎo)致自身免疫性疾病或免疫抑制，有利于感染和腫瘤生長(zhǎng)。以上可能是SERPINA3表達(dá)水平增加促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用機(jī)制，但仍需更進(jìn)一步的探索，為SERPINA3在TNBC患者中靶向治療提供充分的理論依據(jù)。