白細(xì)胞介素-11及其受體在新生缺氧缺血性腦病大鼠模型中的表達(dá)*

左丁，馮占輝，王筱雅，陳惠心，胡穎，張金娟，楊清，葉蘭***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽 550025；3.貴州護(hù)理職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥物教研室，貴州 黔南州 551300；4.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 多媒體機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是新生兒期嚴(yán)重缺氧性腦損傷的結(jié)果，其死亡率和發(fā)病率在全球范圍內(nèi)都很高[1-2]。HIE是由腦組織供血和供氧困難引起的，常與癲癇、腦癱、死亡、短期或長期神經(jīng)和認(rèn)知功能障礙有關(guān)[3]。目前，對臨床相關(guān)的HIE的治療是出生后立即進(jìn)行亞低溫治療[4-5]，但僅靠亞低溫療法并不能提供完全的神經(jīng)保護(hù)，迫切需要輔助治療。成功建立HIE疾病模型，了解HIE的病理變化，尋找切實(shí)有效的靶點(diǎn)至關(guān)重要。白細(xì)胞介素-11(interleukin-11，IL-11)是一種具有血小板生成活性的造血細(xì)胞因子[6]，在機(jī)體多種組織中有表達(dá)，包括大腦、脊髓、腸道和睪丸[7]。IL-11通過與細(xì)胞表面特異性受體-配體結(jié)合鏈白介素-11受體α(interleukin-11 receptor alpha，IL-11Rα)結(jié)合，并連接到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈可溶性糖蛋白130(glycoprotein 130，GP130)后發(fā)揮其生物學(xué)作用[8]，它們主要通過Janus激酶/STAT3、ERK/RAS和mTOR/PI3K 這3種重要途徑進(jìn)行信號(hào)傳遞[9]。研究表明IL-11作為抗炎因子在各種炎癥疾病模型中均表現(xiàn)出抗炎和黏膜保護(hù)作用，如黏膜炎、炎癥性腸病等[10]。有研究認(rèn)為，IL-11使少突膠質(zhì)前體細(xì)胞凋亡減少、有絲分裂增強(qiáng)，其對少突膠質(zhì)細(xì)胞的支持作用與對白細(xì)胞的抑制作用，使IL-11成為哺乳動(dòng)物包括多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病的潛在保護(hù)因子，但是至今還沒有IL-11對HIE疾病作用的相關(guān)報(bào)道。本研究觀察IL-11及受體在新生大鼠HIE疾病模型中的動(dòng)態(tài)變化，為尋找HIE新的協(xié)同治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生Sprague-Dawley(SD)大鼠30只(12～18 g，7日齡)，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄各半。所有與動(dòng)物有關(guān)的試驗(yàn)均獲貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑和儀器 IL-11Rα(4D12)鼠單克隆抗體(sc-13090)、IL-11(A-9)鼠單克隆抗體 (sc-13306)及GP130(E-8)鼠單克隆抗體(sc-376280)均購自美國Santa Cruz公司，蘇木精-伊紅(HE)染液套裝(G1003)購自武漢賽維爾生物科技有限公司，異氟烷麻醉劑(1902801，購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；R580S型小動(dòng)物麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)及AG70厭氧缺氧箱(美國Gene-Science 公司)。

1.2 方法

1.2.1建立HIE大鼠模型 將30只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)(Sham)組和模型(HIE)組，Sham組9只、HIE組21只。各組7日齡新生大鼠稱重后用1%～2%異氟烷麻醉、固定在立體定位儀上，頸部消毒、頸部正中做約5 mm的縱向切口，找到右頸總動(dòng)脈、用縫合線在近心端和遠(yuǎn)心端兩端分別進(jìn)行2次結(jié)扎、并將其從中間剪斷，縫合切口后放回母鼠身邊休息；1 h后，在37 ℃恒溫水浴下用8%O2和92%N2低氧處理2 h；缺氧結(jié)束后，將乳鼠送回母鼠身邊；Sham組麻醉及手術(shù)，但不結(jié)扎右頸總動(dòng)脈和缺氧，其余步驟同模型組[12]。

1.2.2短期行為學(xué)檢測 對造模后48 h的新生大鼠實(shí)施短期行為學(xué)檢測，Sham組和HIE組各6只，包括翻正反射[13]、負(fù)趨地性試驗(yàn)[14]和Longa評(píng)分[15]。

1.2.3HE染色法檢測腦組織病理學(xué)變化 短期行為學(xué)測試結(jié)束后，取Sham組和HIE組各3只大鼠處死、取腦組織、4%多聚甲固定、冠狀切割成小塊備用，切塊包含大腦皮層和海馬體；然后梯度乙醇脫水和二甲苯透明、石蠟包埋、切片。脫蠟：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%酒精 5 min、自來水洗，切片入蘇木素染液染3～5 min、自來水洗，分化液分化、自來水洗、返藍(lán)、流水沖洗；切片依次入85%、95%的梯度酒精脫水各5 min，入伊紅染液中染色5 min。脫水封片后顯微鏡100倍鏡檢，圖像采集分析，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。

1.2.4檢測腦組織IL-11、IL-11Rα、GP130蛋白的表達(dá) 采用免疫印跡(Western blot)法檢測，從Sham組取3只(造模后6 h)，HIE組取15只新生大鼠不同時(shí)間點(diǎn)取大腦組織 (造模后6、12、24、48、72 h組)、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測IL-11、IL-11Rα、GP130的表達(dá)變化。(1)制備蛋白質(zhì)樣品 取適量右側(cè)腦組織(包含大腦的海馬體和大腦皮層)稱重置于玻璃勻漿器中，加入合適體積的RIPA蛋白裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，使用BCA定量盒定量并制樣；(2)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)模；(3)孵育一抗、二抗，一抗為IL-11Rα(4D12，1 ∶200)、GP130(E-8，1 ∶100)、IL-11(A-9，1 ∶100)，二抗為堿性磷酸酶山羊抗鼠IgG(H+L，1 ∶10 000)；(4)ECL發(fā)光液曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 短期行為學(xué)表現(xiàn)

HIE組新生大鼠在缺氧缺血性腦損傷后，翻正反射、負(fù)趨地性試驗(yàn)時(shí)間明顯延長，Longa評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 兩組新生大鼠短期行為學(xué)表現(xiàn)Tab.1 Short-term behavioral performance of neonatal

2.2 腦組織細(xì)胞形態(tài)

與Sham組比較，缺氧缺血損傷48 h后,HIE組腦組織嚴(yán)重壞死、腦干組織結(jié)構(gòu)不清楚、大腦皮層顯示組織損傷、細(xì)胞核固縮、凝集，海馬CA1區(qū)域中可見多發(fā)受損細(xì)胞，細(xì)胞核集中不規(guī)則、排列紊亂。見圖1。

注：紅色箭頭指示受損及壞死細(xì)胞。圖1 兩組大鼠的大腦皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cortical and hippocampal neural cell morphology of rats between two groups

2.3 IL-11蛋白表達(dá)

與Sham組比較，缺氧缺血誘導(dǎo)后，HIE組大鼠腦組織IL-11蛋白水平整體呈現(xiàn)先減后增趨勢，12 h時(shí)組降至最低、從24 h組開始上調(diào)、在72 h時(shí)顯著性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1) 與Sham組比較，P<0.05。圖2 各組大鼠腦組織IL-11蛋白表達(dá)Fig.2 IL-11 protein expression in the rat brain tissue of each group

2.4 腦組織IL-11Rα和GP130蛋白表達(dá)

缺氧缺血損傷后，HIE各組大鼠腦組織勻漿中IL-11Rα和GP130蛋白表達(dá)趨勢均呈現(xiàn)先增加后減少，在24 h時(shí)達(dá)到峰值；與Sham組比較，HIE組在24 h時(shí)IL-11Rα和GP130蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

注：A為IL-11Rα蛋白，B為GP130表達(dá)；與Sham組比較，(1) P<0.01，(2) P<0.05。圖3 各組大鼠腦組織IL-11Rα及GP130蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of IL-11Rα and GP130 protein in the rat brain tissue of each group

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦病的發(fā)病機(jī)制與炎癥相關(guān)，包括巨噬細(xì)胞的活化[16]。隨著自由基和細(xì)胞外谷氨酸水平增高，星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞被激活，釋放炎癥細(xì)胞因子[17]。另外細(xì)胞死亡包括細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡，是導(dǎo)致新生兒腦損傷的重要原因。文獻(xiàn)表明HI造成大量神經(jīng)元凋亡，在不成熟的大腦組織中半胱氨酸蛋白酶caspase-3對凋亡的調(diào)控起重要作用[18]。本實(shí)驗(yàn)短期行為學(xué)結(jié)果表明，HI后新生大鼠的整體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力下降，神經(jīng)認(rèn)知功能發(fā)生障礙。HE結(jié)果顯示，新生大鼠腦組織在缺氧缺血損傷后，海馬CA1區(qū)和皮層區(qū)均受到不同程度的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞水腫、壞死，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。病理結(jié)果證實(shí)HI早期造成大量的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，這與缺氧缺血損傷后腦病理形態(tài)變化的研究結(jié)果一致[19]。有學(xué)者對不同缺血疾病模型中IL-11時(shí)間進(jìn)程變化進(jìn)行了研究，肺缺血再灌注顯示缺血損傷后前6 h IL-11的表達(dá)總體呈上升趨勢[20]；在大腦中動(dòng)脈栓塞模型的研究中，呈現(xiàn)先減后增趨勢[21]。本實(shí)驗(yàn)通過蛋白質(zhì)印跡法檢測內(nèi)源性IL-11在HI后的時(shí)間進(jìn)程表達(dá)水平，與Zhang Bei等[22]研究結(jié)果相似，本研究推測腦缺氧缺血損傷不僅可以增加炎癥因子的釋放，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生抗炎因子進(jìn)行自身防御。有研究顯示GP130mRNA在動(dòng)物的錐體細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)元中表達(dá)，并且在短暫性前腦缺血后GP130mRNA表達(dá)上調(diào)[23]。但未發(fā)現(xiàn)IL-11Rα在相關(guān)缺氧/缺血模型中的檢測。為了確定IL-11靶向結(jié)合的兩個(gè)受體在大腦內(nèi)的存在和表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)也檢測了內(nèi)源性IL-11Rα和GP130蛋白在HI后的時(shí)程表達(dá)變化，結(jié)果提示兩者都在HI后6 h開始增加且在24 h蛋白表達(dá)達(dá)到峰值，其后開始降低。由此推測此靶點(diǎn)在新生大鼠腦內(nèi)是存在的，并參與了HIE疾病模型的病程變化，提示IL-11可能作為治療新生兒缺氧缺血性腦病的重要研究靶點(diǎn)，這具有重要的臨床意義。